Mcl-1在3-溴丙酮酸誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡敏感性中的作用.pdf

1、目的：
　　1.探究3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate，3-BrPA）對人乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　2.研究3-BrPA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡對Caspase的依賴性。
　　3.探討ROS在3-BrPA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡中的作用。
　　4.探討PI3K/Akt通路在3-BrPA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡過程中的作用。
　　5.探討Mcl-1在乳腺癌細(xì)胞對3-BrPA誘導(dǎo)凋亡敏感性中的作用。

2、　　方法：
　　1.MTT法檢測3-BrPA處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-435后對細(xì)胞存活率的影響。
　　2.溴化丙啶（propidium iodide，PI）單染法及Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-43524h后對細(xì)胞存活率的影響。
　　3.DHE檢測試劑盒檢測3-BrPA（160μmol·L-1)處理人乳腺癌細(xì)胞MD

3、A-MB-2311h、3h及6h后細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子水平。
　　4.ATP檢測試劑盒檢測不同濃度3-BrPA（40,80,160μmol·L-1)處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-4356h后細(xì)胞內(nèi)ATP水平。
　　5.Western blot法檢測3-BrPA處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231對凋亡相關(guān)蛋白Mcl-1表達(dá)及PI3K/Akt信號通路的影響。
　　6.利用siRNA技術(shù)下調(diào)Mcl-1觀察

4、MDA-MB-435細(xì)胞對3-BrPA誘導(dǎo)其凋亡敏感性的變化。
　　7.利用過表達(dá)技術(shù)上調(diào)Mcl-1觀察MDA-MB-231細(xì)胞對3-BrPA誘導(dǎo)其凋亡敏感性的變化。
　　結(jié)果：
　　1. 不同濃度3-BrPA對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-435增殖及凋亡的影響
　　1.1 使用不同濃度3-BrPA(10，20，40，80，160μmol·L-1)分別處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MD

5、A-MB-43524h，48h及72h，MTT法檢測細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-BrPA對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231有增殖抑制作用，且隨著濃度的增加和作用時間的延長，3-BrPA對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖抑制作用也不斷增強(qiáng)，而MDA-MB-435細(xì)胞在此濃度范圍未發(fā)現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象。
　　1.2 3-BrPA(40，80，160μmol·L-1)分別處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-43524h，

6、PI單染法檢測結(jié)果顯示：隨著3-BrPA濃度的增加，MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率逐漸增多，而 MDA-MB-435細(xì)胞的凋亡率無明顯變化。Annexin V-FITC/PI雙染法進(jìn)一步驗(yàn)證MDA-MB-231凋亡情況，結(jié)果與單染法所得結(jié)果一致。
　　2. 3-BrPA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231發(fā)生凋亡是非caspase依賴的
　　2.1 使用160μmol·L-13-BrPA分別處理MDA-MB-231細(xì)胞6h，

7、16h及24h， Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，16h組和24h組有一定的Caspase-8和Caspase-3的激活。
　　2.2 使用160μmol·L-13-BrPA分別處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-2311h，3h及6h，DHE檢測結(jié)果顯示：隨著時間的延長，MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)活性氧逐漸增多。
　　2.3 ATP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-BrPA(40，80，160μmol·L-1)對兩株乳腺癌細(xì)胞內(nèi)

8、的ATP生成均起到抑制作用，且呈濃度依賴性。
　　2.4 為了進(jìn)一步確認(rèn)3-BrPA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡是否為caspase依賴，我們使用160μmol·L-13-BrPA和 Caspase抑制劑z-VAD-fmk（20μmol·L-1）聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞，結(jié)果顯示，z-VAD-fmk對發(fā)生凋亡的MDA-MB-231細(xì)胞不具有保護(hù)作用。
　　3. 3-BrPA通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)M

9、cl-1的表達(dá)
　　3.1 使用160μmol·L-13-BrPA分別處理人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231和MDA-MB-4356h，16h及24h，Western blot結(jié)果顯示：在MDA-MB-231細(xì)胞中，24h組Mcl-1及p-Akt的表達(dá)量較對照組，16h組及6h組明顯降低；而在MDA-MB-435細(xì)胞中，6h組、16h組級24h組較對照組有所上升。
　　3.2 使用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY29400

10、2（10μmol·L-1）分別處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-2316h、16h及24h后，Western bolt檢測結(jié)果顯示24h組Mcl-1的表達(dá)量較對照組，16h組及6h組明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：3-BrPA誘導(dǎo) MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡可能是通過 PI3K/Akt通路下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Mcl-1引起的。
　　4. 下調(diào)Mcl-1表達(dá)可增強(qiáng)MDA-MB-435細(xì)胞對3-BrPA誘導(dǎo)凋亡的敏感性
　　4.1 用M

11、cl-1 siRNA預(yù)處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，24h后，Western bolt檢測Mcl-1表達(dá)量明顯降低。沉默Mcl-1的表達(dá)后，用160μmol·L-13-BrPA處理MDA-MB-231細(xì)胞24h，使用MTT法檢測其存活率，并與對照組相比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對照組相比，Mcl-1 siRNA預(yù)處理后，3-BrPA誘導(dǎo)MDA-MB-435細(xì)胞發(fā)生凋亡在一定程度被增強(qiáng)了。
　　4.2 Western blot結(jié)果

12、顯示：沉默Mcl-1的表達(dá)后，使用160μmol·L-13-BrPA處理MDA-MB-435細(xì)胞24h，與對照組相比，處理組有一定的Caspase-3的激活。
　　5. 上調(diào)Mcl-1表達(dá)可降低MDA-MB-231細(xì)胞對3-BrPA誘導(dǎo)凋亡的敏感性
　　5.1 用Mcl-1 cDNA預(yù)處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，24h后，Western bolt檢測Mcl-1表達(dá)量明顯升高。過表達(dá)Mcl-1后，用160μmol·L

13、-13-BrPA處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，使用MTT法檢測其存活率，并與對照組相比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對照組相比，Mcl-1 cDNA預(yù)處理后，3-BrPA誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡一定程度被抑制。
　　5.2 Western blot結(jié)果顯示：過表達(dá)Mcl-1后，使用160μmol·L-13-BrPA處理MDA-MB-231細(xì)胞24h，處理組Caspase-3未發(fā)現(xiàn)激活，細(xì)胞受到保護(hù)。
　　結(jié)論：