3-溴丙酮酸、檸檬酸鈉對胃癌細(xì)胞SGC-7901及裸鼠胃原位移植瘤的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:胃癌(Gastric Cancer,GC)是最常見的惡性腫瘤之一，近年來，雖然手術(shù)，化療、放療等取得了巨大的進(jìn)步，但胃癌的5年生存率仍不理想。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)，提高患者生存率迫在眉睫。80年前Warburg發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞在有氧條件仍然更多依賴糖酵解來獲取能量(Adenosinetriphosphate，ATP)。惡性腫瘤細(xì)胞的這一特點(diǎn)，為抗腫瘤藥物的研究提供了一個靶點(diǎn)，即我們可以通過抑制糖酵解來殺滅腫瘤細(xì)胞。糖酵解反

2、應(yīng)中，己糖激酶(Hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶1(6-Phosphofructokinase-1，PFK-1)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)通過控制反應(yīng)的關(guān)鍵步驟來調(diào)節(jié)糖酵解的速率。因此，如果藥物能抑制這些關(guān)鍵酶的活性，則可以發(fā)揮抗腫瘤的作用。3-溴丙酮酸(3-BrPA)是一種強(qiáng)烷化劑，我們課題組及其他學(xué)者的研究均顯示3-BrPA能通過結(jié)合HK的活性位點(diǎn)，從而抑制該酶的活性。檸檬酸鈉(SCT)是一種常用

3、于食品添加劑中的化合物，我們前期研究表明SCT能通過結(jié)合PFK-1的活性區(qū)域，抑制其活性。因此3-BrPA及SCT能通過抑制關(guān)鍵酶來控制糖酵解的速率，導(dǎo)致細(xì)胞供能減少。而研究已表明當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生能量枯竭時，可出現(xiàn)持續(xù)的DNA降解，線粒體膜通透性改變，引起細(xì)胞色素C(Cyt-C)的釋放，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過對細(xì)胞凋亡通路的研究，能更好的揭示抗腫瘤藥物作用機(jī)制。我們前期研究已經(jīng)證

4、明3-BrPA及SCT能抑制惡性胸膜間皮瘤及胃癌細(xì)胞增殖，但其具體作用的機(jī)制仍未完全闡明，尤其是腹腔內(nèi)應(yīng)用3-BrPA及SCT能否發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)及其作用機(jī)制國內(nèi)外尚未見報道。因此，本實(shí)驗(yàn)首先使用人胃癌細(xì)胞株SGC-7901行3-BrPA及SCT的體外實(shí)驗(yàn)，然后建立裸鼠胃原位移植瘤模型，腹腔內(nèi)注射3-BrPA及SCT行體內(nèi)研究。希望為胃癌治療的探索提供一些可供參考的研究依據(jù)。
　　第一部分、3-溴丙酮酸、檸檬酸鈉對胃癌細(xì)胞影響的體

5、外實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)
　　方法:培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞SGC-7901，MTT法檢測3-BrPA及SCT對其增殖影響，確定體外實(shí)驗(yàn)藥物濃度。分8個實(shí)驗(yàn)組:空白對照組(Control組)，陽性對照組（5-FU組），3-BrPA低、中、高濃度組及SCT低、中、高濃度組。分別用藥后，倒置顯微鏡觀察胃癌細(xì)胞生長情況及形態(tài)改變;流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和周期;Hoechst33258染色法檢測細(xì)胞凋亡，激光共聚焦顯微鏡及熒光探針法檢測reactive oxy

6、gen species(ROS)產(chǎn)量;紫外比色法檢測HK、PFK-1、PK活性，分光光度法檢測ATP和乳酸(Lacticacid，LC)含量;Western blot(WB)檢測凋亡基因蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:3-BrPA、SCT能呈時間及濃度依賴性抑制胃癌細(xì)胞生長，3-BrPA對SGC-7901的半數(shù)抑制濃度(IC50)在24h、48h分別為9.88±1.07μg/ml、5.97±0.95μg/m

7、l。而SCT的IC50在24h、48h分別為6.47±0.87mg/ml、3.84±0.59mg/ml。
　　2.倒置顯微鏡觀察結(jié)果:3-BrPA、SCT及5-FU可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖，隨著3-BrPA、SCT濃度增加，活細(xì)胞數(shù)明顯減少細(xì)胞排列稀疏，變圓，空白對照組細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞呈多邊形。
　　3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果:用藥24 h、48 h后，3-BrPA組及SCT組細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增加或作用時間延長而顯著增高

8、(P＜0.05)。3-BrPA組中細(xì)胞凋亡率由15.60±1.83％增加至84.45±3.97％;SCT組中從19.31±1.89％增至88.34±5.22％。5-FU組細(xì)胞凋亡率在24h及48h分別為61.57±4.30％及92.64±4.15％。用藥24h后，3-BrPA、SCT組及5-FU組中，G2/M期細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P＜0.05)，可見亞二倍體凋亡峰。5-FU組中，S期的細(xì)胞數(shù)也明顯增加(P＜0.05)。
　　4.Ho

9、echst33258染色結(jié)果:3-BrPA、SCT組及5-FU組可見凋亡細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)，表現(xiàn)為核固縮或崩解，細(xì)胞呈明顯的亮藍(lán)色，凋亡率隨3-BrPA、SCT濃度的增高而增大(P＜0.05)，而空白對照組未見明顯的凋亡細(xì)胞。
　　5.ROS產(chǎn)量檢測結(jié)果:用藥4h后，3-BrPA、SCT組及5-FU組中胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量較空白對照組明顯增多(P＜0.05)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，可見亮綠色細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度均隨著3-B

10、rPA、SCT濃度增高而上升（P＜0.05）。
　　6.細(xì)胞內(nèi)HK、PFK-1、PK活性及ATP和LC產(chǎn)量檢測結(jié)果:用藥24h、48h后，3-BrPA組HK活性較SCT組及空白對照組均顯著降低(P＜0.05)，且呈藥物濃度及作用時間依賴性，5-FU組中HK活性亦較SCT組和空白對照組低(P＜0.05)。SCT組HK活性與空白對照組相比未見明顯的差異(P＞0.05)。SCT組PFK-1活性隨藥物濃度增加及作用時間延長而顯著降低(P＜

11、0.05)，3-BrPA組及5-FU組PFK-1活性與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。PK活性在各實(shí)驗(yàn)組中均未見明顯差異(P＞0.05)。3-BrPA組及SCT組ATP和LC產(chǎn)量較空白對照組均明顯減少(P＜0.05)，表現(xiàn)為時間和藥物濃度的依賴性。5-FU處理細(xì)胞8h后ATP產(chǎn)量減少，處理48h后乳酸也較空白對照組降低(P＜0.05)。
　　7.WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Bax、Cyt-C及Cleaved caspase-3

12、蛋白表達(dá)量隨3-BrPA及SCT藥物濃度的增加而明顯增高，而Bcl-2、Survivin蛋白的表達(dá)則較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。5-FU組中Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)較空白對照組明顯降低，而Bax、Cyt-C及Cleaved caspase-3則較之增高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:3-BrPA、SCT在體外能顯著抑制人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，抑制糖酵解關(guān)鍵么活性并通

13、過ROS蓄積，激活線粒體凋亡通路，抑制Survivin蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　第二部分、人胃癌細(xì)胞裸鼠胃原位移植瘤模型構(gòu)建及Micro-PET/CT檢測
　　方法:取6只雌性BALB/C裸鼠，于雙側(cè)前肢腋背部皮下注射200ul胃癌細(xì)胞懸液。待裸鼠皮下瘤長至直徑約8-10mm時，取出皮下移植瘤，進(jìn)行鼠間傳代，共6代。取150只雌性BALB/C裸鼠，麻醉后通過醫(yī)用OB生物膠黏貼法將腫瘤組織塊種植于胃壁漿肌層下，建立裸鼠

14、胃原位癌模型。術(shù)后2周，隨機(jī)分成8組，每組18只，每日一次腹腔注射相應(yīng)藥物，觀察裸鼠體重、飲食及活動度變化。連續(xù)用藥4周后，每組隨機(jī)選取6只裸鼠，利用18F-FDG作為放射性示蹤劑，行Micro-PET/CT掃描，余裸鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建人胃癌細(xì)胞SGC-7901裸鼠胃原位移植瘤模型，成瘤率約95％。
　　2.腹腔注射實(shí)驗(yàn)濃度的3-BrPA及SCT后，裸鼠體重緩慢增長，未見明顯飲食及活動度下降

15、。
　　3.各組胃原位移植瘤病灶放射性示蹤劑集聚值(％ID/g)分別為:3-BrPA-L組2.703±0.214、3-BrPA-M組2.047±0.286、3-BrPA-H組1.348±0.142、SCT-L組2.527±0.279、SCT-M組1.975±0.245、SCT-H組1.228±0.136、5-FU組2.187±0.276、PBS組3.285±0.389。3-BrPA組及SCT組中18F-FDG集聚隨著藥物濃度的升高

16、而減少，與PBS組對比有明顯差異(P＜0.05)。5-FU組中18F-FDG集聚也較PBS組降低，對比具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論:通過醫(yī)用OB生物膠黏貼法可成功構(gòu)建裸鼠胃原位移植瘤模型，腹腔注射3-BrPA及SCT可安全、有效地降低腫瘤細(xì)胞代謝，抑制腫瘤生長。
　　第三部分、3-溴丙酮酸、檸檬酸鈉對裸鼠胃原位移植瘤影響的體內(nèi)研究
　　實(shí)驗(yàn)方法:構(gòu)建裸鼠胃原位移植瘤模型，連續(xù)腹腔注射相應(yīng)藥物4周后，各組隨

17、機(jī)選取6只裸鼠，檢測血常規(guī)及肝腎功能;測量移植瘤體積及重量;HE染色觀察移植瘤組織病理形態(tài)，肝腎組織病理學(xué)改變;紫外比色法檢測移植瘤HK、PFK-1、PK活性，分光光度法檢測ATP及乳酸含量;TUNEL法檢測移植瘤細(xì)胞凋亡;透視電鏡(TEM)觀察移植瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);RT-qPCR檢測相關(guān)凋亡基因mRNA表達(dá);免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測相關(guān)凋亡蛋白表達(dá);各組余裸鼠繼續(xù)用藥至死亡，統(tǒng)計生存時間。
　　結(jié)果:
　　1.裸鼠血常規(guī)

18、及肝腎功能:3-BrPA組及SCT組裸鼠白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、肌酐及尿素氮與PBS組比較，均無明顯差異(P＞0.05);5-FU組裸鼠白細(xì)胞、血小板及白蛋白可見不同程度降低，而谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、肌酐及尿素氮可見不同程度的升高，與PBS組對比均有顯著性差異（P＜0.05）。但各組裸鼠的血紅蛋白未見明顯異常(P＞0.05)。
　　2.移植瘤生長及裸鼠生存時間、3-BrPA組、SCT組及5-FU組移

19、植瘤體積及重量均較PBS組減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，隨著3-BrPA及SCT濃度增加，其瘤體積及瘤重抑制率均增強(qiáng)。3-BrPA組，SCT組及5-FU組裸鼠生存時間均較PBS組明顯延長(P＜0.05)。
　　3.移植瘤HK、PFK-1、PK活性及ATP和LC產(chǎn)量:3-BrPA組HK活性隨藥物劑量增加而降低，而SCT組及PBS組未見明顯改變，對比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，5-FU組HK活性也較SCT組和PBS組減低（

20、P＜0.05）。SCT組PFK-1活性顯著低于3-BrPA組、5-FU組及PBS組(P＜0.05)，呈劑量依賴性改變。各組PK活性未見明顯差異(P＞0.05)。3-BrPA組、SCT組及5-FU組ATP和LC產(chǎn)量與PBS組對比，均可見明顯降低(P＜0.05)，且3-BrPA組及SCT組中ATP和LC產(chǎn)量改變呈藥物濃度依賴性。
　　4.移植瘤及肝腎組織HE染色:移植瘤組織HE染色可進(jìn)一步證明模型成功建立。3-BrPA組及SCT組裸鼠

21、肝腎組織切片中未見明顯組織病理學(xué)改變，而5-FU組可見點(diǎn)狀壞死、細(xì)胞空泡樣改變或炎性細(xì)胞浸潤等改變。
　　5.TUNEL染色及TEM結(jié)果:3-BrPA組及SCT組移植瘤平均凋亡指數(shù)(AI)呈劑量依賴性升高，與PBS組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），5-FU組AI較PBS組亦可見明顯增高（P＜0.05）。3-BrPA組、SCT組及5-FU組移植瘤細(xì)胞中可見典型的細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)改變:細(xì)胞皺縮或破裂，胞核碎裂、染色質(zhì)邊聚，胞質(zhì)

22、內(nèi)空泡形成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫大，線粒體水腫呈空泡樣變性，線粒體嵴模糊、消失，凋亡小體形成等。而PBS組移植瘤細(xì)胞胞核較大核仁明顯，未見明顯凋亡變化。
　　6.IHC結(jié)果:3-BrPA組及SCT組移植瘤中cleaved caspase-9、cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)量隨藥物濃度升高而增多，與PBS組相比均可見明顯差異(P＜0.05)。此外，cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白在5-FU組中

23、表達(dá)量亦明顯高于PBS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　7.RT-qPCR檢測結(jié)果:3-BrPA組及SCT組移植瘤中Bax、Cyt-C mRNA表達(dá)均呈劑量依賴性升高，而Bcl-2、Survivin的表達(dá)則呈劑量依賴性降低，與PBS對照組相比均具有顯著差異(P＜0.05)。同時，在5-FU組移植瘤中Bax、Cyt-C也較PBS組表達(dá)增加，而Bcl-2、Survivin表達(dá)則明顯減少(aP＜0.05)。
　　結(jié)論:腹

24、腔內(nèi)注射3-BrPA及SCT能安全有效的抑制裸鼠原位移植瘤的生長、延長荷瘤鼠生存時間，誘導(dǎo)原位移植瘤細(xì)胞凋亡。
　　全文結(jié)論:本研究分別通過內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，研究3-BrPA及SCT對胃癌細(xì)胞SGC-7901的影響，并探索其抗腫瘤作用機(jī)制。
　　1.體外實(shí)驗(yàn)表明3-BrPA及SCT可通過阻滯細(xì)胞周期，抑制糖酵解關(guān)鍵酶HK及PFK-1的活性、抑制胃癌細(xì)胞糖酵解速率、減少ATP及乳酸產(chǎn)量，導(dǎo)致細(xì)胞能量枯竭。并首次發(fā)現(xiàn)3-BrPA及SC

25、T可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，上調(diào)線粒體凋亡通路中Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，從而引起Cyt-C的釋放，激活caspase-3，同時抑制抗凋亡蛋白Survivin的表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
　　2.通過建立裸鼠胃原位移植瘤模型，在國內(nèi)外屬首次通過腹腔內(nèi)注射途徑應(yīng)用3-BrPA及SCT并結(jié)合18F-FDG Micro-PET/CT掃描來研究評估藥物的抗腫瘤作用，結(jié)果證實(shí)腹腔內(nèi)使用3-BrPA及SCT同樣可以抑制糖酵解酶活