三七萜類骨架生物合成途徑關鍵酶ispG和GGPPS基因的克隆和表達分析.pdf

1、目的:根據(jù)前期三七轉錄組測序結果篩選出位于三七萜類骨架生物合成途徑中的關鍵酶香葉基香葉基焦磷酸合酶(GGPPS)及4-羥基-3-甲基-2-烯基二磷酸合酶(ispG)，克隆得到GGPPS和ispG基因的全長序列信息，初步分析其結構特征、時空表達規(guī)律，探討其對萜類物質代謝的影響。構建GGPPS原核表達載體，為深入酶的功能研究及品質形成的分子遺傳調控提供基礎。
　　方法:在Unigene序列信息基礎上，結合cDNA末端快速擴增(RACE

2、)技術克隆出三七ispG及GGPPS基因全長;運用實時熒光定量PCR，采用雙標準曲線SYBR法分析三七GGPPS和ispG基因在不同發(fā)育時期、不同器官中的時空表達規(guī)律;使用pET-30a(+)構建GGPPS原核表達載體pET-30a(+)-GGPPS，轉入BL(DE3)宿主菌中誘導表達，獲得融合蛋白，并對其進行純化復性。
　　結果:實驗克隆得到ispG基因cDNA全長序列2284 bp，最長開放閱讀框為2223bp，該基因編碼74

3、0個氨基酸，與絨毛煙草、橡膠樹、芝麻的ispG一致性達到89％以上，具有GcpE超家族結構域;實時熒光定量PCR結果顯示，ispG基因在1、2、3年生三七的根、莖、葉和3年生的花等不同器官組織中均有表達，但以葉中具有顯著水平的高表達量，其他組織部位表達量均較低。GGPPS基因cDNA序列全長1203bp的，最長開放閱讀框為1035 bp，GeneBank登錄號為:KM486564，相應基因全長2370bp，包含1個內含子和2個外顯子，該

4、基因編碼344個氨基酸，與蓖麻、丹參等植物GGPPS的一致性達到73％以上，具有富天冬氨酸區(qū)等多個保守結構域，屬于類異戊二烯合成酶超家族;實時熒光定量PCR結果顯示，GGPPS在1、2、3年生三七的根、莖、葉和3年生的花等不同器官組織中均有表達，但以3年生葉中具有顯著水平的高表達量。構建的得到的pET-30a(+)-GGPPS原核表達體系能夠成功表達出pET-30a(+)-GGPPS融合蛋白，實驗考察確定該蛋白的最佳誘導條件為:0.1m

5、mol·L-1 IPTG，誘導6h，該蛋白主要以包涵體形式存在于細胞內，通過Ni-NTA的純化，能夠得到純度較高的融合蛋白。
　　結論:克隆得到三七ispG和GGPPS基因，結合ispG和GGPPS兩個基因時空表達規(guī)律的研究，以及生物信息學分析，認為這兩個基因均參與萜類骨架生物合成途徑，影響三萜的積累和三七品質的形成;與三七葉片葉綠體的發(fā)育、葉綠素和類胡蘿卜素的合成，以及三七的陰生適應性相關。通過對GGPPS原核表達獲得pET-3