三七萜類骨架生物合成途徑關(guān)鍵酶ispG和GGPPS基因的克隆和表達分析.pdf

1、目的:根據(jù)前期三七轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選出位于三七萜類骨架生物合成途徑中的關(guān)鍵酶香葉基香葉基焦磷酸合酶(GGPPS)及4-羥基-3-甲基-2-烯基二磷酸合酶(ispG)，克隆得到GGPPS和ispG基因的全長序列信息，初步分析其結(jié)構(gòu)特征、時空表達規(guī)律，探討其對萜類物質(zhì)代謝的影響。構(gòu)建GGPPS原核表達載體，為深入酶的功能研究及品質(zhì)形成的分子遺傳調(diào)控提供基礎(chǔ)。
　　方法:在Unigene序列信息基礎(chǔ)上，結(jié)合cDNA末端快速擴增(RACE

2、)技術(shù)克隆出三七ispG及GGPPS基因全長;運用實時熒光定量PCR，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線SYBR法分析三七GGPPS和ispG基因在不同發(fā)育時期、不同器官中的時空表達規(guī)律;使用pET-30a(+)構(gòu)建GGPPS原核表達載體pET-30a(+)-GGPPS，轉(zhuǎn)入BL(DE3)宿主菌中誘導(dǎo)表達，獲得融合蛋白，并對其進行純化復(fù)性。
　　結(jié)果:實驗克隆得到ispG基因cDNA全長序列2284 bp，最長開放閱讀框為2223bp，該基因編碼74

3、0個氨基酸，與絨毛煙草、橡膠樹、芝麻的ispG一致性達到89％以上，具有GcpE超家族結(jié)構(gòu)域;實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，ispG基因在1、2、3年生三七的根、莖、葉和3年生的花等不同器官組織中均有表達，但以葉中具有顯著水平的高表達量，其他組織部位表達量均較低。GGPPS基因cDNA序列全長1203bp的，最長開放閱讀框為1035 bp，GeneBank登錄號為:KM486564，相應(yīng)基因全長2370bp，包含1個內(nèi)含子和2個外顯子，該

4、基因編碼344個氨基酸，與蓖麻、丹參等植物GGPPS的一致性達到73％以上，具有富天冬氨酸區(qū)等多個保守結(jié)構(gòu)域，屬于類異戊二烯合成酶超家族;實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，GGPPS在1、2、3年生三七的根、莖、葉和3年生的花等不同器官組織中均有表達，但以3年生葉中具有顯著水平的高表達量。構(gòu)建的得到的pET-30a(+)-GGPPS原核表達體系能夠成功表達出pET-30a(+)-GGPPS融合蛋白，實驗考察確定該蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為:0.1m

5、mol·L-1 IPTG，誘導(dǎo)6h，該蛋白主要以包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi)，通過Ni-NTA的純化，能夠得到純度較高的融合蛋白。
　　結(jié)論:克隆得到三七ispG和GGPPS基因，結(jié)合ispG和GGPPS兩個基因時空表達規(guī)律的研究，以及生物信息學(xué)分析，認(rèn)為這兩個基因均參與萜類骨架生物合成途徑，影響三萜的積累和三七品質(zhì)的形成;與三七葉片葉綠體的發(fā)育、葉綠素和類胡蘿卜素的合成，以及三七的陰生適應(yīng)性相關(guān)。通過對GGPPS原核表達獲得pET-3