桃過敏原表達(dá)鑒定和免疫分析.pdf

1、桃(Prunus persicaL.Batsch)是我國水果過敏中較為常見的種類。國外已鑒定四類桃過敏原(Prup1-Prup4)。但對于我國患者來講，究竟是由哪種主要蛋白引發(fā)過敏缺乏深入的研究。本文主要研究桃過敏原提取物的制備方法，桃過敏原組分的單克隆抗體生產(chǎn)，相關(guān)基因在果實(shí)中表達(dá)差異，重組蛋白的理化和免疫活性鑒定以及桃過敏臨床病例的血清免疫鑒定。分析了桃四類候選過敏基因家族成員在不同組織間的表達(dá)模式差異，鑒別主要表達(dá)成員，比較不同桃

2、品種果實(shí)中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)量，與桃基因組序列中相關(guān)過敏基因數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。開展桃Prup1三個(gè)不同成員的載體構(gòu)建、大腸桿菌體外表達(dá)和純化，鑒定純化產(chǎn)物的理化性質(zhì)、生理功能和免疫活性差異。首次收集中國桃過敏患者血清，分析患者主要過敏原組分和地區(qū)間差異，明確我國桃果實(shí)主要過敏原。主要結(jié)果如下:
　　 1、比較了四種緩沖液提取桃果皮總蛋白粗提物的效果，確定了Coca's緩沖液適宜于桃蛋白粗提取物制備。該方法獲得的產(chǎn)物在桃過敏

3、患者體內(nèi)進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)(SPT)，初步確認(rèn)其免疫活性。免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了桃主要過敏蛋白分子量為9kDa。以重組脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(LTP, Prup3)為免疫原，成功制備鼠單克隆抗體，為桃提取物的標(biāo)準(zhǔn)化以及研究LTP在果實(shí)生長和發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 2、在轉(zhuǎn)錄水平確認(rèn)了在果實(shí)中表達(dá)的7個(gè)關(guān)鍵過敏基因成員，包括Prup1.01，Prup1.06B，Prup2.01A，Prup2.01B，Prup3.01，Prup4.01和Pr

4、up4.02。部分成員具有組織特異性，其中Prup1.02僅在幼葉中表達(dá)，果肉中基本無Prup3.01成員表達(dá)，并且Prup3.02和Prup3.03僅分別在幼葉和花藥中表達(dá)。在11個(gè)桃品種中，Prup1和Prup2兩個(gè)過敏基因家族的關(guān)鍵成員表達(dá)差異較大，而Prup3和Prup4差異較小。在桃基因組序列中新發(fā)現(xiàn)8個(gè)同源基因。Prup1、Prup2和Prup3家族的部分成員以基因簇的形式分布，物理距離分別為80Kb、1.57Mb和20Kb

5、。
　　 3、成功應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)從上清中純化到3個(gè)Prup1成員(Prup1.01，Prup1.02和Prup1.06B)，從包涵體內(nèi)純化到1個(gè)成員(Prup1.03)。分子量質(zhì)譜和MALDI-TOF/TOF肽段匹配實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了蛋白序列的正確性，圓二色譜顯示正確的二級結(jié)構(gòu)和微小差異。在pH3時(shí)三個(gè)成員RNA水解活性喪失，pH5時(shí)僅Prup1.06B表現(xiàn)活性,玉米素可延緩Prup1.01水解活性。3例Prup1陽性血清的IgE

6、結(jié)合和抑制實(shí)驗(yàn)表明，Prup1.06B的免疫活性強(qiáng)于Prup1.01，為新發(fā)現(xiàn)的同源異構(gòu)過敏原。重組過敏蛋白可以進(jìn)一步研究應(yīng)用于診斷制劑產(chǎn)品開發(fā)。
　　 4、本研究共收集39例桃過敏患者血清，利用國際醫(yī)學(xué)界認(rèn)可的ImmunoCAP測定血清中結(jié)合Prup1、Prup3和Prup4的特異免疫球蛋白E(sIgE)含量，結(jié)果表明脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Prup3)為中國桃過敏患者主要過敏原。南方以單獨(dú)桃過敏為主，北方以蒿草花粉過敏伴發(fā)桃過敏為主。