扁豆過敏原蛋白Lenc1的表達鑒定及抗原位點改造研究.pdf

1、背景：
　　扁豆因其豐富的營養(yǎng)價值及愉悅的風(fēng)味成為人們喜愛的一種食物，然而，扁豆卻易于在一些人群，特別是在地中海地區(qū)和亞洲地區(qū)的兒童中引發(fā)由IgE介導(dǎo)的I型過敏反應(yīng)。目前I型過敏反應(yīng)治療的方法為針對過敏原的特異性免疫治療，即脫敏治療。然而，這種方法有可能引發(fā)強烈的過敏反應(yīng)，甚至有致死性的危險。因此，為了避免脫敏治療過程中潛在的風(fēng)險性，采用重組低致敏原蛋白進行免疫治療法具有非常重要的意義。本研究利用基因工程技術(shù)克隆、表達并鑒定重組扁

2、豆過敏原蛋白Len c1，并采用定點突變方法，在蛋白質(zhì)水平對其抗原性進行分析和改造，以獲得低過敏原性甚至是無過敏原性的扁豆重組突變體，為下一步扁豆低過敏原蛋白功能試驗打下基礎(chǔ)，以期為扁豆過敏人群帶來福音。
　　目的：
　　通過基因工程技術(shù)克隆表達重組扁豆過敏原蛋白Len c1及其突變體，為扁豆過敏原的單克隆抗體的制備、免疫治療以及臨床試驗提供實驗材料。
　　方法：
　　1.在 Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索得到

3、扁豆過敏原蛋白 Len c1（登錄號：A0AT29）的氨基酸序列，根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性并利用DNAstar軟件優(yōu)化其RNA二級結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)最優(yōu)化，優(yōu)化后序列送往上海博尚生物技術(shù)有限公司進行合成。
　　2.利用大腸桿菌表達系統(tǒng)重組表達Len c1，通過親和層析純化目的蛋白后用免疫印跡的方法對其進行鑒定。
　　3.因抗原肽激活T細胞前需與MHCП分子的識別，采用NetMHCП在線軟件分析扁豆過敏原蛋白Len c1的氨基酸

4、抗原表位，確定需要改造的MHCП結(jié)合力高即抗原性高的位點，改造這些位點以獲得到低過敏原性的蛋白。
　　4.采用基因定點突變技術(shù)對需要改造的位點進行突變，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中重組表達相關(guān)蛋白，并通過免疫印跡進行鑒定。
　　結(jié)果：
　　1.獲得了經(jīng)優(yōu)化的扁豆過敏原蛋白Len c1的表達序列，并成功構(gòu)建了相應(yīng)的表達載體pet44a-Len c1；
　　2.在大腸桿菌系統(tǒng)中成功的對扁豆過敏原蛋白Len c1進行了表達、鑒