梭子蟹過敏原分析及原肌球蛋白關鍵抗原表位重組表達.pdf

1、目的:
　　 食物過敏是當今重大的衛(wèi)生學問題，食物過敏原的鑒定、純化并制備標準化的過敏原，是食物過敏性疾病診斷和治療的中心環(huán)節(jié)。本研究的目的是分別從分析過敏原和分析待檢IgE多態(tài)性兩方面入手，力爭解決當前血清特異性IgE檢測所存在的問題。首先，以梭子蟹為研究對象，過敏患者血清中的特異性抗體IgE為“探針”，對梭子蟹中的主要過敏原組分進行分析;其次，以蟹過敏患者為研究對象，分析蟹過敏患者血清特異性IgE所針對過敏原的異質性。此外，

2、選擇甲殼類動物共同的過敏原-原肌球蛋白中的一段含有3個抗原表位的多肽，為重組表達對象，重組表達此段多肽，采用原核生物（大腸桿菌）作為表達系.統(tǒng)，制備原肌球蛋白肽段的多肽片段，為今后進行不同過敏原關鍵表位的串聯體表達提供實驗基礎。
　　 方法:
　　 1.梭子蟹過敏原組分的分析:通過去脂、抽提梭子蟹的總蛋白，SDS-PAGE分析蛋白組分，以蟹過敏患者血清中的特異性IgE作為“探針”，經western-blot技術，分析梭子

3、蟹中的主要與特異性IgE結合的組分。
　　 2.蟹過敏患者特異性IgE所針對的過敏原異質性分析:選取50例蟹過敏患者血清，經western-blot技術分析不同的患者血清中的特異性IgE抗體多態(tài)性，即分析蟹過敏患者血清特異性IgE所針對的過敏原個體間存在的異質性。
　　 3.原肌球蛋白中TM32a的重組表達及免疫活性鑒定:選擇原肌球蛋白中的一段含有3個抗原表位的多肽（簡稱為TM32a）。合成TM32a的DNA序列，選擇p

4、ET42a為載體，EcoRI和XhoI雙酶切構建質粒載體，克隆宿主菌Top10擴增重組質粒，利用最常見的原核表達宿主菌大腸桿菌BL21(DE)，以IPTG誘導蛋白表達，并利用載體上的所攜帶的His標簽蛋白，用鎳離子純化柱純化出單一組分的TM32a蛋白，免疫印跡法鑒定該目的蛋白的免疫活性。
　　 結果:
　　 1.梭子蟹過敏原組分的分析:梭子蟹的總蛋白粗提液中共觀察到9條主要蛋白條帶。在以陽性混合血清為探針的印跡中，94k

5、D、74kD、70kD、48kD、43kD、40kD和36kD處均出現了陽性反應條帶，但蛋白濃度較高的74kD和70kD的蛋白與混合血清反應并不是最強的，相反，蛋白含量中等的94kD的蛋白與混合血清反應最強。
　　 2.蟹過敏患者血清特異性IgE所針對的過敏原的異質性分析:以單例蟹患者血清為研究對象的western-blot實驗中，發(fā)現不同的患者血清中的特異性IgE存在明顯的異質性，即不同人的反應蛋白數量和種類都有所不同，其中:

6、①1種蛋白為主要過敏原;②兩種以上蛋白均為主要過敏原;③沒有強反應的主要過敏原，而僅有幾種較輕反應的過敏原。統(tǒng)計發(fā)現，其中以36kD的蛋白反應率最高，可達80％。
　　 3.原肌球蛋白中TM32a的重組表達及免疫活性鑒定:合成的原肌球蛋白中的TM32a的DNA序列大小為96bp左右，與pET-42a連接構建質粒載體，大小為6030bp左右，將構建好的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE)，IPTG誘導表達后，獲得大小為34kD左右的重

7、組蛋白TM32a，將重組蛋白經鎳離子柱純化柱純化后，獲得單一組分的34kD大小的TM32a，并經免疫印跡法證明其具有免疫活性。
　　 結論:
　　 1.梭子蟹中有7個主要過敏原組分，其中94kD的過敏原與混合患者血清的反應強度最強。
　　 2.蟹過敏患者血清中的特異性IgE抗體所針對的過敏原存在明顯的異質性，共確定了3種不同的患者血清中特異性IgE所針對的過敏原類型，分析9種主要過敏原的反應率，其中反應率最高的過