血管束植入聯(lián)合細(xì)胞移植治療兔股骨頭壞死骨缺損模型的實驗研究.pdf

1、目的：探討血管束植入聯(lián)合同種異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療兔股骨頭壞死骨缺損模型的可行性，探索治療股骨頭壞死的一種新方法，為進一步的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。 方法：1同種異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植前準(zhǔn)備：穿刺兔雙側(cè)髂后上棘，抽取3ml骨髓，種植于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入條件培養(yǎng)液(15％胎牛血清、100u/ml青霉素鈉、100u/ml鏈霉素、10mmol/Lβ甘油磷酸鈉，10-8mmol/L地塞米松，50mg/L維生素C)5ml,細(xì)胞培養(yǎng)箱中培

2、養(yǎng)。5天后首次換液，以后每3天換液一次。第三代細(xì)胞行低溫凍存，7天后復(fù)蘇，繼續(xù)培養(yǎng)，傳到第五代細(xì)胞時，向每個培養(yǎng)瓶中加入BrdU100μl，BrdU的終濃度為2ug/ml。長滿瓶底后消化、離心、制懸，復(fù)合細(xì)胞于膠原蛋白海綿上，每塊海綿含20萬個細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5小時備用。將第五代的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞做鈣化結(jié)節(jié)檢測及BMP免疫組化檢測。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與膠原蛋白海綿復(fù)合5小時后用甲醛固定，脫水、包埋、切片，行HE染色。2實驗動物的處理：

3、36只新西蘭大耳白兔隨機分成A、B、C3組，A組12只為單純造模組，B組12只為同種異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植組，C組12只為同種異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合血管束植入組。所有動物的雙側(cè)股骨頭均參加實驗。取仰臥位，髖關(guān)節(jié)前側(cè)切口，液氮冷凍股骨頭3分鐘，復(fù)溫后從股骨頸前內(nèi)側(cè)向股骨頭內(nèi)鉆孔鉆孔至關(guān)節(jié)軟骨下。A組不進行干預(yù)；B組骨缺損處植入復(fù)合同種異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的膠原蛋白海綿；C組植入復(fù)合同種異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的膠原蛋白海綿，同時植入腹壁淺動、

4、靜脈束。各組分別于術(shù)后2周、4周、8周、12周各處死3只實驗動物。所獲的股骨頭標(biāo)本分別做X線檢查、組織切片HE染色、BrdU免疫組織化學(xué)染色，進一步測算股骨頭冠狀截面的血管密度及新生骨小梁在骨缺損區(qū)所占的面積百分比，做統(tǒng)計分析。 結(jié)果：1骨髓基質(zhì)干細(xì)胞：經(jīng)條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，第五代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞載片鈣化結(jié)節(jié)檢測陽性，BMP免疫組化檢測陽性。倒置顯微鏡下觀察可見典型的成骨細(xì)胞形態(tài)。光鏡下見，膠原蛋白海綿孔隙大而豐富，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞充填

5、于膠原蛋白海綿的空隙，部分絀胞已貼壁。股骨頭標(biāo)本切片后行免疫組織化學(xué)染色，可見成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的核均呈棕褐色，證實新生骨小梁是由所移植的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞形成。2股骨頭X線檢查：A組標(biāo)本：2周時缺損區(qū)以外密度有所增加，骨小梁結(jié)構(gòu)完整；缺損區(qū)密度低，4周時，缺損邊緣密度有所增高。8周時可見囊性變，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，缺損區(qū)邊緣形成硬化線，鉆孔中心密度仍較低。12周時，股骨頭均塌陷變形，個別出現(xiàn)股骨頭碎裂。B組在缺損區(qū)以外的表現(xiàn)與A組基本一致，在鉆

6、孔缺損區(qū)，從兩周時密度開始增高，成骨面積、密度逐漸增加。C組的標(biāo)本在缺損區(qū)以外的早期表現(xiàn)與A、B兩組相司，從第8周開始壞死未進一步發(fā)展，12周的標(biāo)本仍能保持外形，沒有出現(xiàn)塌陷。從4周開始缺損區(qū)的密度與成骨面積較A、B兩組司期的標(biāo)本要大。3股骨頭組織切片觀察：A組標(biāo)本：2周時股骨頭關(guān)節(jié)面軟骨細(xì)胞層變薄，頭下骨小梁變細(xì)。僅缺損區(qū)的邊緣形成少量的類骨質(zhì)及新生骨小梁；4周時部分壞死骨小梁開始吸收，骨小梁不規(guī)則，出現(xiàn)骨折，關(guān)節(jié)軟骨面磨損加重。缺損

7、區(qū)邊緣骨小梁有所增多；8周時骨吸收和骨折加重，但大部分標(biāo)本尚未出現(xiàn)明顯塌陷，股骨頭缺損邊緣仍然在修復(fù)，缺損區(qū)出現(xiàn)大量的骨髓組織；12周時關(guān)節(jié)軟骨面塌陷，股骨頭缺損區(qū)填充大量骨髓組織，僅缺損區(qū)邊緣形成少量的骨小梁。B組的標(biāo)本在缺損區(qū)以外的表現(xiàn)同A組基本一致，在缺損區(qū)2周可見大量的成骨細(xì)胞增生，并開始形成骨小梁，可見少量的漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，4周時骨小梁增多，漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞明顯減少，8周時有大量骨小梁形成，但骨小梁相對幼稚、稀疏、排列紊亂。

8、C組的標(biāo)本2周時缺損區(qū)可見原始的毛絀血管生成，8周時缺損區(qū)新生骨小梁板層狀或編織狀，毛細(xì)血管豐富，可見紅細(xì)胞、血小板等結(jié)構(gòu)，12周時缺損區(qū)骨小梁變寬變粗，排列規(guī)則，可見成熟的骨小梁組織及新生骨髓。經(jīng)統(tǒng)計分析，B、C兩組股骨頭冠狀截面的血管密度及新生骨小梁在骨缺損區(qū)所占的面積比，2周時p＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義，4、8、12周時p＜0.05，C組股骨頭冠狀截面的血管密度及新生骨小梁在骨缺損區(qū)所占的面積比均比同時期B組的大。 結(jié)論：

9、1經(jīng)過冷凍復(fù)蘇、多次消化傳代、并向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)的同種異體成年兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞免疫排斥力弱，能在液氮冷凍股骨頭壞死骨缺損區(qū)形成新生骨小梁，可以用作異體移植。2BrdU免疫組化染色證實：股骨頭壞死骨缺損區(qū)的新生骨小梁是由移植的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞所形成；移植的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的最終轉(zhuǎn)歸是新生骨小梁。3植入股骨頭壞死骨缺損區(qū)的腹辟淺動靜脈束可以有效的改善股骨頭的血運，同時給所移植的細(xì)胞提供營養(yǎng)，促進新生骨小梁的形成。4定向誘導(dǎo)的同種異體骨髓基質(zhì)干