IL-33在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、第一部分 IL-33及其受體在慢性阻塞性肺疾病患者中的表達(dá)變化
　　目的：慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種肺部慢性炎癥性疾病,其特征是炎癥細(xì)胞活化和炎癥介質(zhì)的釋放。白細(xì)胞介素-33(IL-33)是具有免疫調(diào)節(jié)作用的白細(xì)胞介素-1（IL-1）家族新成員，在各種炎癥和免疫疾病中起著重要作用,但I(xiàn)L-33是否參與COPD發(fā)病機(jī)制仍不清楚。本部分實驗?zāi)康脑谟谔接慖L-33及其受體ST2和IL-1受體輔助蛋白（IL-1 RAcP）在COP

2、D患者中的表達(dá)水平。
　　方法：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測112例COPD患者和115例對照組血漿IL-33、ST2、IL-1 RAcP的濃度，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血細(xì)胞IL-33表達(dá)情況；將12例因肺部非腫瘤性疾病行肺葉切除術(shù)患者按肺功能情況分為COPD組（6例）和對照組（6例），用免疫熒光染色法檢測氣道IL-33的表達(dá)情況，并用Western Blot方法對氣道組織中IL-33蛋白水平進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：與對照組相比，C

3、OPD組血漿IL-33、ST2、IL-1RAcP濃度均升高，外周血中IL-33主要由淋巴細(xì)胞表達(dá)，COPD組IL-33陽性淋巴細(xì)胞比例明顯高于對照組，中性粒細(xì)胞中IL-33陽性比例較低，兩組無顯著性差異。IL-33在肺內(nèi)主要表達(dá)在氣道上皮細(xì)胞，COPD組平均熒光強(qiáng)度高于對照組，且COPD組氣道組織中IL-33蛋白水平較對照組明顯升高。
　　結(jié)論：IL-33、ST2和IL-1Racp在COPD患者中的表達(dá)均升高，且IL-33主要來源

4、于外周血淋巴細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞。
　　第二部分香煙煙霧誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病中IL-33的表達(dá)和釋放
　　目的：吸煙是COPD發(fā)病的重要危險因素，香煙中的有害成分刺激機(jī)體產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，參與COPD的發(fā)生和進(jìn)展，香煙煙霧是否可以直接誘導(dǎo)IL-33的表達(dá)尚不清楚，因此，研究香煙煙霧對IL-33表達(dá)和釋放的影響是本部分實驗的目的。
　　方法：12只小鼠隨機(jī)被分為對照組和熏煙組；熏煙組小鼠分別暴露于香煙煙霧中8個月，用HE染

5、色法觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變，Real-time PCR法檢測小鼠PBMCs中IL-33和ST2的轉(zhuǎn)錄，ELISA方法檢測小鼠血漿IL-33和ST2的釋放，Western Blot法檢測小鼠氣道中IL-33的蛋白表達(dá)量；培養(yǎng)HBE細(xì)胞，分成4組：對照組（CM組），CSE組，LPS組，CSE+LPS組；Western Blot法檢測各組IL-33的表達(dá)水平，ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-33水平，Annexin V-FITC/PI雙染

6、法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的損傷和凋亡。
　　結(jié)果：與對照組相比，熏煙組小鼠肺泡間隔破壞明顯；熏煙組小鼠PBMCs的IL-33和ST2基因轉(zhuǎn)錄水平和血漿IL-33和ST2濃度較對照組升高，熏煙組小鼠氣道中IL-33的蛋白表達(dá)也明顯升高；另外，體外細(xì)胞實驗證實CSE和LPS能夠刺激HBEs IL-33表達(dá)增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-33的濃度也呈現(xiàn)相應(yīng)的增高趨勢。
　　結(jié)論：吸煙可以刺激IL-33在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)和釋放，在體外條件下，C

7、SE和LPS能夠促HBE中IL-33表達(dá)和釋放。
　　第三部分 TLR4在香煙煙霧致IL-33表達(dá)增高中的作用
　　目的：探討TLR4是否參與調(diào)節(jié)香煙煙霧致IL-33的表達(dá)，研究TLR4基因單核苷酸多態(tài)性與吸煙者IL-33的差異表達(dá)的關(guān)系。
　　方法：24只小鼠隨機(jī)分為4組：對照組，TAK242腹腔注射組，香煙煙霧暴露組，TAK242腹腔注射+香煙煙霧暴露組，每組6只； Western blot法檢測TLR4和IL-3

8、3在小鼠氣道中的蛋白表達(dá)量，Real-time PCR法檢測小鼠PBMCs TLR4和IL-33基因的轉(zhuǎn)錄水平；培養(yǎng)HBE細(xì)胞，分成6組：對照組，TAK242組，CSE組，CSE+TAK242組，LPS組，LPS+TAK242組，Real-time PCR法和Western Blot法檢測各組IL-33和TLR4的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。測序法檢測20例吸煙健康者和20例吸煙COPD患者中TLR4基因rs4986790、rs4986791和

9、rs11536889位點多態(tài)性。
　　結(jié)果：動物實驗中，與對照組相比，小鼠氣道組織中TIL4和IL-33的蛋白表達(dá)水平在S組顯著升高，小鼠PBMCs TLR4和IL-33的基因轉(zhuǎn)錄水平在S組也明顯升高，且TAK242可以明顯抑制香煙煙霧暴露小鼠氣道和PBMCs中IL-33的表達(dá)。體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，與對照組比較，CSE可以誘導(dǎo)HBEs TLR4mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平增加，且TAK242可以明顯抑制CSE和LPS誘導(dǎo)的IL-33

10、表達(dá)。TLR4基因單核苷酸多態(tài)性檢測結(jié)果顯示：在所有研究對象中，rs4986790位點和rs4986791位點均未發(fā)現(xiàn)等位基因，健康吸煙者組和COPD患者組之間 rs11536889位點等位基因的頻率無顯著性差異，兩組中來自rs11536889位點GG基因型的受試者與來自CG基因型的受試者血漿IL-33蛋白水平比較均未見顯著性差異。
　　結(jié)論：TLR4參與香煙煙霧誘導(dǎo)的IL-33表達(dá)調(diào)控，TLR4基因單核苷酸多態(tài)性可能與吸煙者IL