孕酮調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞水平促進(jìn)彌漫性軸索損傷大鼠神經(jīng)功能修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本課題組先期研究已證實(shí)提高循環(huán)血內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitorcells，EPCs)水平能改善創(chuàng)傷性顱腦損傷的預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）的EPCs的變化趨勢(shì)。結(jié)合臨床患者和DAI大鼠模型，我們觀察了循環(huán)血EPCs在DAI的變化規(guī)律并嘗試通過孕酮(progesterone，PROG)調(diào)節(jié)DAI大鼠的循環(huán)血EPCs水平，以觀察孕酮促進(jìn)DAI大鼠損

2、傷區(qū)腦組織的血管生成和神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。
　　 方法:
　　 1）選取DAI患者15例和出血性腦外傷(traumatic intracerebralhemorrhage，TIH)患者26例。利用流式細(xì)胞儀測(cè)定患者傷后1d、4d、7d、14d、21d的循環(huán)血EPCs數(shù)量，以格拉斯哥預(yù)后評(píng)分(GOS)為患者傷后6個(gè)月的預(yù)后評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2）建立Marmarou DAI大鼠模型，選用Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分為

3、假手術(shù)組、單純DAI組、DAI安慰劑組和DAI孕酮治療組。其中孕酮治療組于傷后1h立即給予腹腔注射孕酮16mg/kg，隨后于傷后6h，24h給予皮下注射相同劑量的孕酮，隨后每日一次連續(xù)給予5d;安慰劑組在相同的給藥時(shí)間點(diǎn)給予等量安慰劑（二甲基亞砜，DMSO）;假手術(shù)組與單純DAI組均不予任何治療。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定大鼠傷后3h，6h，24h，3d，7d，14d循環(huán)血中的EPCs數(shù)量。取損傷腦組織應(yīng)用免疫熒光進(jìn)行CD34染色，以觀察創(chuàng)傷區(qū)

4、腦組織血管新生情況。傷后1d、7d、14d和21d利用改良神經(jīng)損傷評(píng)分法（Modified Neurological Severity Scores，mNSS）連續(xù)對(duì)四組大鼠進(jìn)行評(píng)分，評(píng)定其行為學(xué)功能變化。傷后14d開始連續(xù)5d以Morris水迷宮(MWM)試驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期和空間搜索試驗(yàn)的目標(biāo)象限逗留時(shí)間百分比及跨越原平臺(tái)位置次數(shù)。第20天記錄大鼠腦部穿通纖維到海馬齒狀回通路的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term po

5、tentiation，LTP)，結(jié)果以興奮性突觸后電位（excitatory post-synaptic potential，EPSP）斜率與EPSP基線值比較的百分?jǐn)?shù)表示。
　　 結(jié)果:
　　 1）DAI患者與前期TBI和同期TIH患者一樣，其循環(huán)血EPCs水平呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，但是增加的幅度不如TIH患者明顯，且于7d、14d和21d與TIH患者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Logistic回歸分析、

6、線性相關(guān)分析以及受試者工作特征曲線(ROC)均發(fā)現(xiàn)，EPCs數(shù)量與DAI預(yù)后相關(guān)性不強(qiáng)。
　　 2）分別用HE染色和β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)免疫組織化學(xué)染色檢查結(jié)合傷后24h的MRI，證實(shí)成功建立了DAI動(dòng)物模型。檢測(cè)單純DAI組和安慰劑組大鼠的EPCs變化與DAI患者相似，呈現(xiàn)相對(duì)平坦的趨勢(shì)，而同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的孕酮治療組的大鼠的EPCs水平明顯升高，并于治療7d后到達(dá)高峰(P＜0.05)，后逐漸下降，但仍然維持在一個(gè)較高

7、水平一直持續(xù)到傷后14d。孕酮治療組傷后7d創(chuàng)傷區(qū)周圍及傷側(cè)海馬的CD34+細(xì)胞與安慰劑組相比較均不同程度升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。mNSS評(píng)分結(jié)果顯示，與安慰劑組比較，孕酮治療組大鼠傷后7d的行為學(xué)功能得到明顯改善(P＜0.05)。水迷宮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，孕酮治療組大鼠傷后14d的逃避潛伏期明顯少于安慰劑組和單純DAI組，而目標(biāo)象限逗留時(shí)間百分比和跨越原平臺(tái)位置次數(shù)明顯比安慰劑組和單純DAI組升高(P＜0.05)。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)顯示

8、孕酮治療組大鼠傷后20d的LTP明顯高于安慰劑組和單純DAI組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:DAI患者的循環(huán)血EPCs水平在傷后沒有明顯升高，呈現(xiàn)相對(duì)平坦的趨勢(shì)。我們分析正是由于DAI患者EPCs總體水平持續(xù)性偏低，可能是導(dǎo)致臨床上DAI患者預(yù)后不良的一個(gè)重要因素，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。我們?cè)诔晒⒌腄AI大鼠模型上發(fā)現(xiàn)了同樣的EPCs變化趨勢(shì)。在給予DAI大鼠孕酮治療后，結(jié)果顯示PROG能明顯增強(qiáng)DAI大鼠骨髓EPC