HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基序相互作用蛋白的篩選與鑒定研究.pdf

1、乙肝病毒感染是全球性的公共衛(wèi)生問題，在我國危害尤其嚴(yán)重。流行病學(xué)調(diào)查表明，我國人口乙肝病毒的感染率為57．63％，HBsAg陽性者為10．34％，據(jù)統(tǒng)計平均每年約有30萬人死于乙肝相關(guān)終末期肝病和肝癌。我國慢性乙肝感染有一個特點是對已上市的抗病毒藥物反應(yīng)低或無應(yīng)答。目前認(rèn)為造成抗病毒療效不令人滿意的原因為：①HBV復(fù)制模板cccDNA頑固地存在肝細(xì)胞核內(nèi)，現(xiàn)有的抗病毒藥物，對cccDNA無效；②HBV容易變異；③HBV感染引起機(jī)體免疫耐

2、受。而慢性乙型肝炎治療的核心問題是抗病毒，因此為了取得更好的治療效果，針對不同的抗HBV的靶位和機(jī)制開發(fā)研制新的藥物勢在必行，而且應(yīng)該具有很好的前景。 乙肝病毒可以從復(fù)制、表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等多個環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)自身復(fù)制和宿主免疫機(jī)能，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的第一步，曾被認(rèn)為是基因表達(dá)的主要調(diào)控機(jī)制。但是隨著對轉(zhuǎn)錄后調(diào)控越來越多的了解，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在基因表達(dá)調(diào)控中同樣起著重要作用。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控決定著基因表達(dá)最終產(chǎn)物的種類和表達(dá)量。

3、 HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)控涉及多個環(huán)節(jié)，HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基序(HBVpost-transcriptionalregulatoryelement，HPRE)的作用是其中重要一環(huán)?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為這段序列在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮著順式調(diào)節(jié)作用，抑制轉(zhuǎn)錄體的剪接同時促進(jìn)轉(zhuǎn)錄體由細(xì)胞核向細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)運。雖然HPRE的作用機(jī)制至今還不是完全清楚，但是認(rèn)為HPRE依賴與細(xì)胞蛋白的結(jié)合來發(fā)揮它的作用，因此驗證HPRE結(jié)合蛋白就可以幫助明確HPRE在HBVRNA輸出中發(fā)

4、揮的作用。 為此，本研究擬在已有的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步尋找和驗證HPRE結(jié)合蛋白，希望能夠找到新的HPRE結(jié)合蛋白，特別是抑制性結(jié)合蛋白，并以此為基礎(chǔ)去探索HPRE與其結(jié)合蛋白在HBV感染后在機(jī)體內(nèi)復(fù)制過程中所發(fā)揮的重要作用及作用機(jī)制，希望能夠找到一條新的途徑可以完全阻斷HBV復(fù)制，為開發(fā)抗HBV感染新藥提供新的思路和靶位。 第一部分 用T7一剛A聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基序 目的：構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄的模板。利

5、用T7-RNA聚合酶，以體外轉(zhuǎn)錄的方法在體外制備足量、高純度的HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基序(HBVpost-transcriptionalregulatoryelement，HPRE)，為進(jìn)一步篩選HPRE相互作用蛋白奠定基礎(chǔ)。 方法：與本實驗室保存的HBV全基因組序列進(jìn)行比對和同源性分析后，自行設(shè)計引物，用PCR的方法得到HPRE基因片段。將PCR產(chǎn)物插入質(zhì)粒pGEM．1lzf的內(nèi)切酶位點EcoRI，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-nzf-HP

6、RE。用內(nèi)切酶XholI對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切后，以線性化的重組質(zhì)粒pGEM—llz~HPRE為模板，利用T7-RNA聚合酶，以體外轉(zhuǎn)錄的方法在體外合成HPRE，通過RNA電泳和分光光度計分析得到的HPRE的質(zhì)和量。 結(jié)果：用PCR技術(shù)成功地以含HBV全基因組的重組質(zhì)粒pGEM-luc-HBV為模板獲得HPRE基因片段，長度為636bp。并且成功地將該片段插入質(zhì)粒pGEM—llzf的多克隆位點，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-¨zf-HPR

7、E，經(jīng)酶切和測序鑒定正確。以線性化的重組質(zhì)粒pGEM-¨zf-HPRE為模板，利用T7-RNA聚合酶，以體外轉(zhuǎn)錄的方法在最佳的條件下合成HPRE，RNA電泳證實其片段大小與預(yù)期值相符，分光光度計定量得到的RNA是DNA模板量的四十余倍。 結(jié)論：我們建立了理想的體外轉(zhuǎn)錄體系，并且可以進(jìn)一步擴(kuò)大反應(yīng)體積，制備出我們研究所需要的足量的HPRE。 第二部分 從人肝細(xì)胞cDNA噬菌體表面展示文庫中篩選llpRE相互作用蛋白

8、 目的：從人肝細(xì)胞的cDNA噬菌體表面展示文庫中篩選和富集與HPRE相互作用的特異性噬菌體克隆，再通過生物信息學(xué)方法獲取HPRE相互作用蛋白的相關(guān)序列信息。 方法：通過噬菌體滴度分析和PCR評價原始cDNA文庫質(zhì)量。以HPRE為靶分子，經(jīng)三輪篩選人肝細(xì)胞的cDNA噬菌體表面展示文庫。同樣利用結(jié)合噬菌體滴度分析和PCR法評價各輪篩選后的特異性富集效果，對特異性富集的噬菌體cDNA插入片段進(jìn)行序列測定和生物信息學(xué)分析。 結(jié)果

9、：對購買的人肝細(xì)胞cDNA噬菌體表面展示文庫進(jìn)行噬菌體滴度分析，結(jié)果表明原始cDNA文庫中包含的獨立重組子克隆數(shù)高達(dá)5．97x10一，具有較高的庫容量。隨機(jī)挑取原始cDNA文庫中的重組子單克隆進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明插入cDNA片段長度大小不一，能夠較好地代表起源細(xì)胞中mRNA的種類和豐度。 人肝細(xì)胞cDNA噬菌體表面展示文庫經(jīng)過三輪篩選后，噬菌體滴度分析表明隨著淘洗次數(shù)的增加噬菌體滴度都有所增加，證明每一輪篩選后與HPRE特異

10、性結(jié)合的陽性克隆明顯增多，特異性的陽性克隆經(jīng)過篩選后得到富集。對三輪篩選后噬菌體的cDNA插入片段進(jìn)行PCR分析，結(jié)果顯示絕大多數(shù)PCR產(chǎn)物都為相同長度(約350bp)，測序結(jié)果表明不同克隆的350bpPCR產(chǎn)物序列完全一致，證實經(jīng)過三輪篩選后含有特定cDNA插入片段的克隆得到富集。測序結(jié)果在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索和比對(BLAST)，發(fā)現(xiàn)TIAlcytotoxicgranule-associatedRNA-bindin

11、gprotein-likelisoform2variantprotein與我們的序列同源性最高。 結(jié)論：特異性富集和分離出表達(dá)HPRE相互作用蛋白的噬菌體克隆，并獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列信息，證明與HPRE相互作用的蛋白可能為TIAl。 第三部分 體外驗證HPRE和TIA1的相互作用 目的：在體外證明TIAl與HPRE能夠發(fā)生結(jié)合，并通過初步的功能實驗，證明二者的結(jié)合是特異性結(jié)合。 方法： 1．通過體

12、外轉(zhuǎn)錄技術(shù)得到HPRE，通過原核表達(dá)、谷胱甘肽一瓊脂糖樹脂純化得到融合蛋白TIAl一GST。將融合蛋白TIAl—GST與HPRE進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，并同時以HPRE和蛋白GST作為陰性對照。反應(yīng)產(chǎn)物行PAGE電泳，然后直接用EB染色后顯色，觀察結(jié)果。 2．利用質(zhì)粒pDMl38和pDMl38-PRE，將TIAl的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3-FLAG-TIAl和上述兩個質(zhì)粒分組，按照一定比列轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2，通過ELISA檢測報告基因CA

13、T的表達(dá)和統(tǒng)計學(xué)分析來對TIAl與HPRE的相互作用進(jìn)行功能鑒定。 結(jié)果： 1．融合蛋白TIAl一GST與HPRE進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)后，電泳可見與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合形成復(fù)合體的HPRE與未與蛋白質(zhì)形成復(fù)合體的HPRE移動速度存在明顯差異，而陰性對照則無此現(xiàn)象，說明融合蛋白與HPRE發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)。 2．檢測報告基因CAT的表達(dá)量，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDMl38-PRE的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDMl38的細(xì)胞能顯著增加CAT表達(dá)量