人CYP2D6野生型和誘變體在COS-7及Sf9細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、細(xì)胞色素P450(CYPs)是一類含有血紅素輔基,可在幾乎所有生命有機(jī)體中存在的超級酶家族。這種酶參與催化內(nèi)源性和外源性底物在體內(nèi)的氧化反應(yīng),如類固醇、致癌物質(zhì)和藥物等。臨床上約90％的藥物是由CYP450超家族中的CYP1A2、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4等7種主要同工酶負(fù)責(zé)代謝的。盡管CYP2D6只占整個肝微粒體CYP含量的2%～5%,但卻參與臨床上大約20%～25%的藥物代

2、謝,包括抗抑郁藥、抗精神病藥、抗心律失常藥、β-受體阻滯劑和鎮(zhèn)痛藥等。CYP酶對藥物的代謝由CYP的活性部位(中心)決定的,該活性部位是由一些氨基酸殘基組成,其中的一些關(guān)鍵氨基酸對藥物-酶之間的相互作用發(fā)揮關(guān)鍵性的作用?，F(xiàn)在的研究已基本確定了CYP2D6活性位點的一些關(guān)鍵氨基酸殘基:D301、E216、F483和F120,它們是主要的底物識別結(jié)合位點,但目前對它們在藥物代謝中的作用尚缺乏全面系統(tǒng)的研究。
　　 目的：建立CYP2

3、D6野生型和誘變體的COS細(xì)胞表達(dá)體系和桿狀病毒介導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),體外表達(dá)CYP2D6野生型和F1201、E216F、D301N、F483A5種重組酶,為進(jìn)一步進(jìn)行CYP2D6關(guān)鍵氨基酸位點對藥物代謝選擇性和特異性影響的研究打下堅實的基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴以本室保存pCMV/Myc-CYP2D6野生型和誘變體重組質(zhì)粒為模板,設(shè)計包含EcoRI和XhoI的特異性引物,PCR擴(kuò)增CYP2D6野生型和誘變型基因。⑵將pIRES2

4、-EGFP載體和擴(kuò)增后的基因片段同時經(jīng)過EcoRI和XhoI雙酶切,T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,卡那霉素抗性篩選陽性克隆,擴(kuò)增,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定。⑶將構(gòu)建的重組質(zhì)粒plRES2-EGFP-CYP2D6用改良的磷酸鈣介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后14h～16h更換培養(yǎng)液。48h后鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。⑷收集轉(zhuǎn)染后72h細(xì)胞,研磨法提取含重組蛋白的S9組分,用鼠抗人CYP2D6單克隆抗體作為一抗,HRP標(biāo)記

5、的山羊抗小鼠IgG為二抗,Western blotting檢測CYP2D6的表達(dá)。⑸將本室保存的pCMV/Myc-CYP2D6重組質(zhì)粒和pFastBacTM1質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切,膠回收酶切片段,將回收的CYP2D6野生型及誘變體片段分別用T4連接酶與pFastBacTM1酶切片段連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性克隆培養(yǎng),提取質(zhì)粒,酶切和測序鑒定。⑹將pFastBac-CYP2D6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E

6、.coli DHIOBac感受態(tài)細(xì)胞,同時pFastBacTM1空質(zhì)粒平行操作。經(jīng)過轉(zhuǎn)座,產(chǎn)生重組粘粒DNA(Bacmid-X)。通過藍(lán)白篩選實驗,挑選純白色克隆培養(yǎng),經(jīng)過3～4次的純化后獲得單一、陽性的克隆。堿裂解法提取重組粘粒,用M13特異性引物進(jìn)行PCR驗證。⑺將經(jīng)PCR驗證正確無誤的重組粘粒與Cellfectin(R)Ⅱ Reagent混合,在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。出現(xiàn)感染癥狀后,收集第一代病毒液。利用收獲的一代病毒液

7、繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞,3～4天后使用相同的方法收集二代病毒液。再經(jīng)過3～4次的擴(kuò)增得到滴度較高的病毒液。⑻在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞,培養(yǎng)至融合度約為80%～90%。換液,加CYP2D6和CYPOR病毒液共感染細(xì)胞。27℃培養(yǎng)24h,添加新鮮配置的血紅素溶液。繼續(xù)培養(yǎng),96h收獲細(xì)胞。直接提取蛋白或凍于液氮中備用。⑼收集感染72h后的細(xì)胞,Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)成cDNA。用CYP2D6特異性引物進(jìn)行PCR,1%的瓊脂糖凝膠電泳

8、分析。⑽提取細(xì)胞的S9組分,用鼠抗人CYP2D6單克隆抗體作為一體,HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為第二抗體,Western blotting檢測CYP2D6的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①以pCMV/Myc-CYP2D6為模板擴(kuò)增的片段長度約為1500bp,與編碼CYP2D6的序列長度一致。②卡那霉素抗性下篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒,經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切,均得到約5300kb和1500kb的片段,測序證實讀碼框正確無誤。鑒定正確質(zhì)粒

9、命名為pIRES2-CYP2D6WT、pIRES2-CYP2D6F120I、pIRES2-CYP2D6E216F、pIRES2-CYP2D6D301N和pIRES2-CYP2D6F483A。③構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,鏡下觀察,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞可以看到綠色熒光,而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則未能觀察到熒光。④轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒COS-7細(xì)胞在約55kDa左右有特異性條帶,而未轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞則在此位置沒有條帶。⑤提取質(zhì)粒,構(gòu)建的載體質(zhì)粒經(jīng)Ec

10、oRI和XhoI雙酶切均得到約5000kb和1500kb的片段,測序證實讀碼框正確無誤。所得的重組質(zhì)粒命名為pFastBac-CYP2D6WT、pFastBac-CYP2D6F120I、pFastBac-CYP2D6E216F、pFastBac-CYP2D6D301N和pFastBae-CYP2D6F483A。⑥利用提取的Bacmid-CYP2D6、Bacmid-pFastBac和Bacmid-DH10Bac粘粒作為模板,使用M13(+

11、)/M13(-)作為特異性引物進(jìn)行PCR驗證,未發(fā)生轉(zhuǎn)座的空Bacmid、重組Bacmid-pFastBac質(zhì)粒和重組Bacmid-CYP2D6的PCR擴(kuò)增出的條帶分別約為300bp、2300bp和3800bp。⑦采用Cellfectin(R)Ⅱ Reagent在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞,96h后可以觀察到細(xì)胞變大變圓,邊緣變亮,懸浮的細(xì)胞開始增多,即成功感染細(xì)胞,收集一代病毒。用所獲的病毒液繼續(xù)感染細(xì)胞,經(jīng)過4～5次擴(kuò)增獲得了

12、適合表達(dá)蛋白的病毒液。⑧感染5種重組病毒的Sf9細(xì)胞均能擴(kuò)增出約1500bp的目的片段,而未感染的細(xì)胞則未能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段。說明CYP2D6野生型和4種突變體在Sf9細(xì)胞中成功的實現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄。⑨未感染重組病毒的Sf9細(xì)胞在約55kD的位置沒有特異性的條帶,而感染了CYP2D6重組病毒的Sf9細(xì)胞在55kD的位置有特異性的條帶,說明CYP2D6野生型和突變體蛋白質(zhì)在St9細(xì)胞中成功實現(xiàn)了表達(dá)。
　　 結(jié)論：⑴成功構(gòu)建了帶有CY