水稻瘤矮病毒P8和Pns10基因在sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：利用bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)RGDV-P8和RGDV-Pns10基因加以表達(dá)，得到RGDV-P8和RGDV-Pns10基因的真核表達(dá)產(chǎn)物，為RGDV-P8和RGDV-Pns10的功能研究奠定基礎(chǔ)。 方法：在RGDV-P8和RGDV-Pns10基因組片段的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到RGDV-P8和RGDV-Pns10 ORF，將其克隆到供體質(zhì)粒pFastBac<'TM>HTb中，經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定后，將測(cè)序

2、正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH0Bac菌，經(jīng)篩選、鑒定后，抽提并獲取高純度的重組穿梭載體Bacmid-RGDV-P8和Bacmid-RGDV-Pns10。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組穿梭載體Bacmid-RGDV-P8和Bacmid-RGDV-Pns10轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組病毒，并反復(fù)擴(kuò)增后得到大量表達(dá)RGDV-P8和RGDV-Pns10蛋白的重組桿狀病毒。用重組的桿狀病毒再次感染sf9昆蟲細(xì)胞得到RGDV-P8和RGDV-Pns10融合蛋白，對(duì)融

3、合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定。 結(jié)果： 1．構(gòu)建了攜帶RGDV-p8和RGDV-ns10基因片段的重組供體質(zhì)粒pfastbacHTb-RGDV-P8和pfastbacHTb-RGDV-Pns10，經(jīng)雙酶切鑒定和序列分析證實(shí)RGDV-P8和RGDV-Pns10基因已正確插入供體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。 2．構(gòu)建了攜帶RGDV-P8和RGDV-Pns10基因片段的重組穿梭載體Bacmid-R

4、GDV-P8和Bacmid-RGDV-Pns10，經(jīng)PCR鑒定分析證實(shí)RGDV-P8和RGDV-Pns10基因已正確轉(zhuǎn)座插入穿梭載體的轉(zhuǎn)座位點(diǎn)。 3．用bac-to-bac系統(tǒng)表達(dá)了RGDV-P8和RGDV-Pns10融合蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE、Westem-blot分析鑒定，分子量約為48kD和38kD，與融合蛋白的理論分子量相符。 結(jié)論：本研究成功地在桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了RGDV-P8和RGDV-Pns