腫瘤細胞Survivin、GRP78的表達與其雙干擾siRNA協(xié)同誘導肝癌細胞凋亡及其機制.pdf

1、目的：腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一非常復雜的過程，涉及多因素的參與，其病因及發(fā)生機制尚不完全清楚，研究證明Survivin 選擇性高表達于多種腫瘤，與腫瘤的級別增高、高復發(fā)率和病人的低存活率相關(guān)聯(lián)，而在正常組織低表達，沉默其表達可作為誘導腫瘤細胞凋亡的策略，然而通過沉默Survivin的表達誘導腫瘤細胞凋亡并未取得滿意的效果。有研究表明，腫瘤發(fā)生過程中，腫瘤細胞異常高表達GRP78以對抗凋亡并促進腫瘤的耐藥、復發(fā)及轉(zhuǎn)移。GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可促進

2、蛋白質(zhì)的正確折疊，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能；在核內(nèi)，可與DNA結(jié)合上調(diào)抗凋亡分子的表達；在胞漿可與caspase7、12結(jié)合，阻止caspase12釋放入胞漿后所啟動的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其誘導的凋亡級聯(lián)反應。因此，當微環(huán)境存在各種不利因素時，腫瘤細胞可通過異常高表達GRP78以對抗凋亡。本課題組前期研究證明，在胃癌組織高表達GRP78，推測與其腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在此基礎(chǔ)上本課題研究檢測了Survivin和GRP78在肝細胞癌患者的組織標本和腫瘤細胞

3、系中的表達，進一步構(gòu)建了沉默Survivin和GRP78的雙干擾siRNA 質(zhì)粒，并探討了沉默腫瘤細胞Survivin和GRP78基因協(xié)同誘導腫瘤細胞凋亡的效應及其可能的機制。
　　 方法：
　　 1.免疫組化法檢測臨床肝細胞癌組織標本Survivin和GRP78的表達對31例肝細胞癌組織石蠟塊切片標本進行免疫組化法檢測癌灶和癌旁組織Survivin和GRP78的表達。
　　 2.流式細胞術(shù)間接免疫熒光法檢測He

4、pG2等腫瘤細胞Survivin和GRP78表達
　　 用兔抗人Survivin/羊抗人GRP78和FITC標記的羊抗兔二抗/驢抗羊二抗檢測腫瘤細胞胞GRP78的表達；0.1％的皂苷破膜后檢測腫瘤細胞胞漿Survivin和GRP78的表達。利用CellQuest軟件進行參數(shù)獲取和資料分析。
　　 3.熒光顯微鏡觀察肝癌細胞HepG2和肝細胞L02胞內(nèi)Survivin和GRP78的表達收集體外培養(yǎng)的HepG2和肝細胞L02

5、細胞，細胞爬片后用兔抗人Survivin/羊抗人GRP78和FITC標記的羊抗兔二抗/驢抗羊二抗孵育，用Olympus BX51熒光顯微鏡觀察蓋玻片上細胞Survivin/GRP78的表達。
　　 4.干擾質(zhì)粒載體構(gòu)建使用Ambion Target finder設(shè)計Survivin和GRP78mRNA的干擾序列，采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建特異性沉默 Survivin、GRP78及沉默Survivin/GRP78雙干擾siRNA，所有質(zhì)

6、粒均帶增強型GFP基因作為熒光標記，分別命名為pgsiRNA-sur1、pgsiRNA-sur2，pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp，無關(guān)對照質(zhì)粒為pgsiRNA-C。
　　 5.細胞轉(zhuǎn)染用LipofectamineTM2000將pgsiRNA-C、pgsiRNA-sur、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2，轉(zhuǎn)染后48h收集細胞檢測。
　　 6.

7、流式細胞術(shù)檢測細胞轉(zhuǎn)染效率，熒光顯微鏡觀察GFP表達收集細胞于離心管中，采用流式細胞儀檢測GFP的表達；利用CellQuest軟件進行參數(shù)獲取和分析。利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染陽性細胞GFP的表達。
　　 7.Real-Time PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞胞內(nèi)Survivin和GRP78mRNA的表達提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，熒光定量PCR檢測干擾質(zhì)粒pgsiRNA-sur、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+gr

8、p轉(zhuǎn)染細胞Survivin和GRP78 mRNA的表達。
　　 8.Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后胞內(nèi)survivin和GRP78蛋白的表達提取細胞總蛋白，分離、轉(zhuǎn)膜后，用兔抗人Survivin多克隆IgG抗體/羊抗人GRP78多克隆IgG抗體，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗/辣根過氧化物酶標記的驢抗羊IgG二抗檢測干擾質(zhì)粒pgsiRNA-sur、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp轉(zhuǎn)染細胞Surv

9、ivin和GRP78蛋白的表達。
　　 9.MTT法檢測轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后細胞增殖細胞轉(zhuǎn)染后24、48、72h進行MTT染色，用酶聯(lián)測定儀在570nm波長檢測每孔的光密度值（OD值），檢測細胞增殖率＝（實驗管OD值/對照管OD值）×100％。
　　 10.FCM測定腫瘤細胞凋亡干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h收集細胞，AnnexinV-APC和 PI染色，F(xiàn)CM檢測腫瘤細胞的凋亡。利用CellQuest軟件進行參數(shù)獲取和資料分析。

10、>　　 結(jié)果：
　　 1.肝癌組織中Survivin和GRP78的表達：免疫組化檢測結(jié)果顯示，肝癌組織中癌細胞胞漿染色Survivin和GRP78陽性細胞的比例均明顯高于癌旁肝組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；2．腫瘤細胞株Survivin和GRP78的表達：在L02、K562、Raji及HepG2細胞株中GRP78 mRNA的表達無顯著差異，GRP78 mRNA在AGS、HeLa、7721和MCF-7細胞株中表達量高于

11、L02。在L02和HepG2、Raji及K562腫瘤細胞株中，僅在MCF-7胞膜GRP78相對高表達，其他細胞株不表達或少量表達。HepG2胞漿中Survivin高于L02。3．不同siRNA載體鑒定結(jié)果：pgsiRNA-sur1、pgsiRNA-sur2、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp通過酶切、測序結(jié)果表明干擾載體構(gòu)建成功。4．pgsiRNA-sur沉默效應與抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡：針對Survivin不

12、同序列的siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2，Real Time PCR和Western blot分別檢測mRNA和蛋白的表達，結(jié)果表明，pgsiRNA-sur1和pgsiRNA-sur2均可沉默Survivin mRNA和蛋白的表達，MTT法檢測細胞增殖以及FCM檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，pgsiRNA-sur1和pgsiRNA-sur2均可抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡，但pgsiRNA-sur2沉默Survivin和誘導細胞凋亡效

13、果更明顯。同時研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pgsiRNA-sur的人肝癌細胞株HepG2與轉(zhuǎn)染無關(guān)質(zhì)粒pgsiRNA-C和未轉(zhuǎn)染對照組比較，轉(zhuǎn)染pgsiRNA-sur的HepG2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白 GRP78表達水平升高，轉(zhuǎn)染無關(guān)質(zhì)粒pgsiRNA-C與未轉(zhuǎn)染對照組比較無顯著差異。5．Survivin和GRP78雙干擾RNA沉默效應與抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡：pgsiRNA-sur2與pgsiRNA-grp以及pgsiRNA-sur2+grp轉(zhuǎn)染人肝

14、癌細胞株HepG2，MTT法檢測細胞增殖以及FCM檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，pgsiRNA-sur2+grp抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡效應顯著高于轉(zhuǎn)染單干擾質(zhì)粒及對照質(zhì)粒組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：肝細胞癌組織中Survivin和GRP78高表達；肝癌細胞株HepG2中Survivin高表達，主要位于細胞質(zhì)，而胞質(zhì)GRP78表達與L02無顯著性差異，與肝癌組織中GRP78表達水平不一致，提示在體內(nèi)，肝癌細胞可能

15、遭受腫瘤微環(huán)境的壓力，誘導GRP78高表達；針對Survivin的siRNA質(zhì)粒pgsiRNA-sur2可有效沉默Survivin mRNA和蛋白的表達，并可抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡；并且發(fā)現(xiàn)siRNA沉默Survivin的表達亦可上調(diào)HepG2細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白GRP78的表達。進一步研究證明Survivin/GRP78雙干擾siRNA能夠有效沉默HepG2細胞Survivin和GRP78基因的表達，誘導腫瘤細胞凋亡；并且證明pg