腫瘤細(xì)胞Survivin、GRP78的表達(dá)與其雙干擾siRNA協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制.pdf

1、目的：腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一非常復(fù)雜的過程，涉及多因素的參與，其病因及發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，研究證明Survivin 選擇性高表達(dá)于多種腫瘤，與腫瘤的級(jí)別增高、高復(fù)發(fā)率和病人的低存活率相關(guān)聯(lián)，而在正常組織低表達(dá)，沉默其表達(dá)可作為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的策略，然而通過沉默Survivin的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并未取得滿意的效果。有研究表明，腫瘤發(fā)生過程中，腫瘤細(xì)胞異常高表達(dá)GRP78以對(duì)抗凋亡并促進(jìn)腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可促進(jìn)

2、蛋白質(zhì)的正確折疊，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能；在核內(nèi)，可與DNA結(jié)合上調(diào)抗凋亡分子的表達(dá)；在胞漿可與caspase7、12結(jié)合，阻止caspase12釋放入胞漿后所啟動(dòng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，當(dāng)微環(huán)境存在各種不利因素時(shí)，腫瘤細(xì)胞可通過異常高表達(dá)GRP78以對(duì)抗凋亡。本課題組前期研究證明，在胃癌組織高表達(dá)GRP78，推測(cè)與其腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在此基礎(chǔ)上本課題研究檢測(cè)了Survivin和GRP78在肝細(xì)胞癌患者的組織標(biāo)本和腫瘤細(xì)胞

3、系中的表達(dá)，進(jìn)一步構(gòu)建了沉默Survivin和GRP78的雙干擾siRNA 質(zhì)粒，并探討了沉默腫瘤細(xì)胞Survivin和GRP78基因協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)及其可能的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.免疫組化法檢測(cè)臨床肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本Survivin和GRP78的表達(dá)對(duì)31例肝細(xì)胞癌組織石蠟塊切片標(biāo)本進(jìn)行免疫組化法檢測(cè)癌灶和癌旁組織Survivin和GRP78的表達(dá)。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)間接免疫熒光法檢測(cè)He

4、pG2等腫瘤細(xì)胞Survivin和GRP78表達(dá)
　　 用兔抗人Survivin/羊抗人GRP78和FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗/驢抗羊二抗檢測(cè)腫瘤細(xì)胞胞GRP78的表達(dá)；0.1％的皂苷破膜后檢測(cè)腫瘤細(xì)胞胞漿Survivin和GRP78的表達(dá)。利用CellQuest軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析。
　　 3.熒光顯微鏡觀察肝癌細(xì)胞HepG2和肝細(xì)胞L02胞內(nèi)Survivin和GRP78的表達(dá)收集體外培養(yǎng)的HepG2和肝細(xì)胞L02

5、細(xì)胞，細(xì)胞爬片后用兔抗人Survivin/羊抗人GRP78和FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗/驢抗羊二抗孵育，用Olympus BX51熒光顯微鏡觀察蓋玻片上細(xì)胞Survivin/GRP78的表達(dá)。
　　 4.干擾質(zhì)粒載體構(gòu)建使用Ambion Target finder設(shè)計(jì)Survivin和GRP78mRNA的干擾序列，采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建特異性沉默 Survivin、GRP78及沉默Survivin/GRP78雙干擾siRNA，所有質(zhì)

6、粒均帶增強(qiáng)型GFP基因作為熒光標(biāo)記，分別命名為pgsiRNA-sur1、pgsiRNA-sur2，pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp，無關(guān)對(duì)照質(zhì)粒為pgsiRNA-C。
　　 5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染用LipofectamineTM2000將pgsiRNA-C、pgsiRNA-sur、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2，轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞檢測(cè)。
　　 6.

7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)收集細(xì)胞于離心管中，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP的表達(dá)；利用CellQuest軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和分析。利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞GFP的表達(dá)。
　　 7.Real-Time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞內(nèi)Survivin和GRP78mRNA的表達(dá)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，熒光定量PCR檢測(cè)干擾質(zhì)粒pgsiRNA-sur、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+gr

8、p轉(zhuǎn)染細(xì)胞Survivin和GRP78 mRNA的表達(dá)。
　　 8.Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胞內(nèi)survivin和GRP78蛋白的表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，分離、轉(zhuǎn)膜后，用兔抗人Survivin多克隆IgG抗體/羊抗人GRP78多克隆IgG抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗/辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊IgG二抗檢測(cè)干擾質(zhì)粒pgsiRNA-sur、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp轉(zhuǎn)染細(xì)胞Surv

9、ivin和GRP78蛋白的表達(dá)。
　　 9.MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后細(xì)胞增殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48、72h進(jìn)行MTT染色，用酶聯(lián)測(cè)定儀在570nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔的光密度值（OD值），檢測(cè)細(xì)胞增殖率＝（實(shí)驗(yàn)管OD值/對(duì)照管OD值）×100％。
　　 10.FCM測(cè)定腫瘤細(xì)胞凋亡干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞，AnnexinV-APC和 PI染色，F(xiàn)CM檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。利用CellQuest軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析。

10、>　　 結(jié)果：
　　 1.肝癌組織中Survivin和GRP78的表達(dá)：免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，肝癌組織中癌細(xì)胞胞漿染色Survivin和GRP78陽性細(xì)胞的比例均明顯高于癌旁肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；2．腫瘤細(xì)胞株Survivin和GRP78的表達(dá)：在L02、K562、Raji及HepG2細(xì)胞株中GRP78 mRNA的表達(dá)無顯著差異，GRP78 mRNA在AGS、HeLa、7721和MCF-7細(xì)胞株中表達(dá)量高于

11、L02。在L02和HepG2、Raji及K562腫瘤細(xì)胞株中，僅在MCF-7胞膜GRP78相對(duì)高表達(dá)，其他細(xì)胞株不表達(dá)或少量表達(dá)。HepG2胞漿中Survivin高于L02。3．不同siRNA載體鑒定結(jié)果：pgsiRNA-sur1、pgsiRNA-sur2、pgsiRNA-grp和pgsiRNA-sur2+grp通過酶切、測(cè)序結(jié)果表明干擾載體構(gòu)建成功。4．pgsiRNA-sur沉默效應(yīng)與抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：針對(duì)Survivin不

12、同序列的siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2，Real Time PCR和Western blot分別檢測(cè)mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，pgsiRNA-sur1和pgsiRNA-sur2均可沉默Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖以及FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，pgsiRNA-sur1和pgsiRNA-sur2均可抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但pgsiRNA-sur2沉默Survivin和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效

13、果更明顯。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pgsiRNA-sur的人肝癌細(xì)胞株HepG2與轉(zhuǎn)染無關(guān)質(zhì)粒pgsiRNA-C和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染pgsiRNA-sur的HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白 GRP78表達(dá)水平升高，轉(zhuǎn)染無關(guān)質(zhì)粒pgsiRNA-C與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較無顯著差異。5．Survivin和GRP78雙干擾RNA沉默效應(yīng)與抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：pgsiRNA-sur2與pgsiRNA-grp以及pgsiRNA-sur2+grp轉(zhuǎn)染人肝

14、癌細(xì)胞株HepG2，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖以及FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，pgsiRNA-sur2+grp抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)顯著高于轉(zhuǎn)染單干擾質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：肝細(xì)胞癌組織中Survivin和GRP78高表達(dá)；肝癌細(xì)胞株HepG2中Survivin高表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)，而胞質(zhì)GRP78表達(dá)與L02無顯著性差異，與肝癌組織中GRP78表達(dá)水平不一致，提示在體內(nèi)，肝癌細(xì)胞可能

15、遭受腫瘤微環(huán)境的壓力，誘導(dǎo)GRP78高表達(dá)；針對(duì)Survivin的siRNA質(zhì)粒pgsiRNA-sur2可有效沉默Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)，并可抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；并且發(fā)現(xiàn)siRNA沉默Survivin的表達(dá)亦可上調(diào)HepG2細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78的表達(dá)。進(jìn)一步研究證明Survivin/GRP78雙干擾siRNA能夠有效沉默HepG2細(xì)胞Survivin和GRP78基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；并且證明pg