長鏈非編碼RNA ENST00000434223抑制非小細胞肺癌的機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　非小細胞肺癌包括腺癌和鱗狀細胞癌，是所有癌癥中最常見的類型，也是全世界癌癥相關(guān)死亡的最主要原因之一。由于非小細胞肺癌的早期通常沒有癥狀，大部分患者在疾病晚期才被確診。近年來，盡管外科手術(shù)和放化療治療方法已經(jīng)取得了長足的進步，肺癌的預(yù)后仍然令人沮喪，其5年生存率只有15％。因此，揭示非小細胞肺癌發(fā)展的分子機制，尋找新的非小細胞肺癌的診斷標志物及治療靶點尤為重要，也是肺癌研究領(lǐng)域的難點。
　　最近的一項研究用微

2、陣列的方法檢測了人肺腺癌樣品中特異表達的長鏈非編碼RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA ENST00000434223在早期肺腺癌組織中表達下調(diào)，但是對于其在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的功能和機制仍知之甚少。本課題擬分三個部分，揭示ENST00000434223與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性及其調(diào)控非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展的具體機制，運用過表達及 siRNA敲低技術(shù)研究ENST00000434223對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的調(diào)控，并研究其對腫

3、瘤細胞周期、凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響，探討ENST00000434223作為非小細胞肺癌潛在的早期診斷標志物及治療靶點的可能性。
　　第一部分長鏈非編碼RNA ENST00000434223表達譜研究及其表達水平和臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性分析
　　目的：
　　比較正常支氣管上皮細胞與非小細胞肺癌細胞株中長鏈非編碼 RNA ENST00000434223的表達水平，以及56對人類非小細胞肺癌與其匹配的相鄰非癌組織中 ENS

4、T00000434223的表達水平，并分析 ENST00000434223的表達水平與56位非小細胞肺癌病人的各項臨床特征的相關(guān)性，探討其作為非小細胞肺癌的早期診斷標志物及治療靶點的可能性。
　　方法：
　　用TRIzol法抽取正常支氣管上皮細胞及各非小細胞肺癌細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用Real time-PCR比較兩者中ENST00000434223的表達水平；用TRIzol法抽取56對人類非小細胞肺癌及與其匹

5、配的相鄰非癌組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用Real time-PCR比較兩者中ENST00000434223的表達水平，并分析 ENST00000434223的表達水平與56位非小細胞肺癌病人的各項臨床特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　細胞系Real time-PCR結(jié)果顯示，與正常支氣管上皮細胞系（16HBE）相比，長鏈非編碼RNA ENST00000434223在非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549,SK-MES-1，SPC

6、-A1和NCI-H1975中的表達水平均下調(diào)，其中，ENST00000434223在A549細胞中表達最高，在NCI-H1975細胞中表達最低。
　　組織Real time-PCR檢測發(fā)現(xiàn)與匹配的相鄰正常組織相比，ENST00000434223在癌組織的表達水平顯著下調(diào)（P<0.01），且低ENST00000434223表達水平與腫瘤直徑（P<0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05），TNM分期（P<0.05）相關(guān)，但與其他因素，例

7、如年齡、性別和腫瘤分化不相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　長鏈非編碼RNA ENST00000434223在非小細胞肺癌細胞株和非小細胞肺癌組織中均下調(diào)；長鏈非編碼RNA ENST00000434223的低表達與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期正相關(guān)，與年齡、性別及腫瘤分化無關(guān)。
　　第二部分長鏈非編碼RNA ENST00000434223抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和生長機制研究
　　目的：
　　確定長鏈非編碼RNA

8、 ENST00000434223對非小細胞肺癌細胞增殖和生長的影響，并確定其是否通過調(diào)控非小細胞肺癌的細胞周期和凋亡來影響肺癌細胞增殖和生長。
　　方法：
　　用瞬時轉(zhuǎn)染和siRNA技術(shù)過表達或敲低 ENST00000434223，再用CCK-8細胞計數(shù)試劑盒檢測其對肺癌細胞增殖的調(diào)控，并用免疫印跡的方法確定其對增殖細胞核內(nèi)抗原 PCNA蛋白水平的影響，然后再用流式細胞儀檢測過表達或敲低ENST00000434223對細胞周

9、期的調(diào)控，用免疫印跡確定其對細胞周期調(diào)控因子p21蛋白水平的影響，最后用PI染色的方法檢測其對細胞凋亡的影響。另外，我們還建立了裸鼠異種移植模型，在裸鼠體內(nèi)研究過表達ENST00000434223對肺癌細胞生長的影響。
　　結(jié)果：
　　H1975細胞的細胞存活率隨著ENST00000434223的過表達而減少，而A549細胞的存活率隨著 ENST00000434223的敲低而相應(yīng)增加。與此相符，ENST00000434223

10、過表達的H1975細胞中細胞核抗原（PCNA）的蛋白水平降低了60%左右，ENST00000434223敲低的A549細胞中細胞核抗原（PCNA）的蛋白水平是對照細胞中的3倍。
　　流式細胞分析檢測發(fā)現(xiàn)ENST00000434223過表達誘發(fā)了H1975細胞在G0/G1期的阻滯，而敲低ENST00000434223則降低了A549細胞在G0/ G1期的細胞所占百分比。與這些結(jié)果相一致，免疫印跡實驗表明當ENST0000043422

11、3在H1975細胞中過表達時，p21蛋白水平提高為對照細胞的2倍，在A549細胞中敲低ENST00000434223表達后，p21蛋白水平則下降了60%左右。
　　為了進一步確定ENST00000434223抑制非小細胞肺癌細胞增殖的功能是否通過誘導(dǎo)細胞凋亡，我們用流式細胞儀檢測了當ENST00000434223在H1975細胞中過表達時的細胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ENST00000434223過表達顯著增加了H1975細胞的凋亡（

12、3-4倍）。
　　與體外實驗相一致，裸鼠異種移植模型實驗表明過表達 ENST00000434223的非小細胞肺癌細胞在裸鼠體內(nèi)的生長顯著降低。
　　結(jié)論：
　　ENST00000434223的過表達降低非小細胞肺癌細胞H1975細胞的存活率和該細胞中細胞核抗原（PCNA）的蛋白水平；敲低 ENST00000434223的表達增加非小細胞肺癌細胞A549細胞的存活率和該細胞中細胞核抗原（PCNA）的蛋白水平；ENST00

13、000434223過表達誘發(fā)了H1975細胞在G0/ G1期的細胞阻滯，并上調(diào)p21蛋白水平；敲低ENST00000434223則降低了A549細胞在G0/ G1期的細胞所占百分比及 p21蛋白水平；ENST00000434223過表達顯著增加了H1975細胞的凋亡3-4倍。過表達ENST00000434223的非小細胞肺癌細胞H1975在裸鼠體內(nèi)的生長顯著降低，且其Ki67的陽性率降低。這些結(jié)果表明，長鏈非編碼RNA ENST0000

14、0434223可以通過誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞的G0/G1阻滯及凋亡來抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和生長。
　　第三部分長鏈非編碼RNA ENST00000434223抑制非小細胞肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲機制研究
　　目的：
　　確定長鏈非編碼RNA ENST00000434223對非小細胞肺癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響，并確定其是否通過調(diào)控非小細胞肺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變來影響肺癌細胞侵襲。
　　方法：
　　用瞬時轉(zhuǎn)染和si

15、RNA技術(shù)過表達或敲低長鏈非編碼 RNA ENST00000434223，再檢測其對非小細胞肺癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的調(diào)控。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）已經(jīng)被證明可促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，接下來我們用免疫組化及免疫印跡的方法檢測過表達 ENST00000434223對非小細胞肺癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響，確定ENST00000434223是否通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變來影響非小細胞肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。
　　結(jié)果：
　　遷移和侵襲實驗結(jié)果表

16、明，過表達ENST00000434223顯著降低了非小細胞肺癌細胞H1975的遷移和侵襲的能力，而敲低ENST00000434223則顯著增加了非小細胞肺癌細胞A549的遷移和侵襲的能力。
　　免疫熒光分析表明，ENST00000434223過表達的H1975細胞擁有更全面的上皮細胞形態(tài)，ENST00000434223過表達導(dǎo)致了E-鈣粘蛋白水平顯著增加，以及 N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達的顯著降低。免疫印跡分析證實了免疫熒光分析的

17、結(jié)果：其中E-鈣粘蛋白水平是對照細胞的4倍，而N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平則分別為對照細胞的13%和19%。
　　結(jié)論：
　　ENST00000434223可以顯著降低非小細胞肺癌細胞H1975的遷移和侵襲的能力；ENST00000434223過表達的H1975細胞擁有更全面的上皮細胞形態(tài)；ENST00000434223抑制非小細胞肺癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變。這些結(jié)果表明，ENST00000434223可以通過抑制非小細胞肺癌