長鏈非編碼RNA ICR促進肝癌發(fā)生的作用及機制研究.pdf

1、研究目的:
　　肝癌是一種致死率較高的常見惡性腫瘤疾病。我國是肝癌大國，占世界肝癌患者的半數(shù)以上。由于多數(shù)患者在確診時已經(jīng)處于中晚期且肝癌異質(zhì)性較大，大多數(shù)患者治療效果不良、預(yù)后較差。揭示肝癌的發(fā)病機制、探尋有效的治療方式是目前肝癌研究領(lǐng)域的焦點。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后較差的主要風(fēng)險因素。門靜脈癌栓(Portal vein tumor thrombosis，PVTT)是一種常見肝癌并發(fā)癥，由肝癌腫瘤細(xì)胞侵潤肝門靜脈形成。

2、肝癌伴發(fā)門靜脈癌栓患者預(yù)后較差。揭示癌栓的發(fā)生機制，了解癌栓發(fā)生的根本原因能夠幫助尋找輔助肝癌治療的新療法改善患者預(yù)后。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制中的重要一環(huán)。大量的研究已經(jīng)證實lncRNA分子在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。另外，腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要因素。研究已經(jīng)表明肝癌腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)?。lncRNA及腫瘤干細(xì)胞在肝癌的發(fā)生和

3、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用，但兩者在肝癌轉(zhuǎn)移特殊類型——門靜脈癌栓發(fā)生中的作用及具體的相關(guān)機制未見文獻報道。本研究的主要目的為:1）揭示門靜脈癌栓特異的基因表達譜;2）探討lncRNA及肝癌腫瘤干細(xì)胞在門靜脈癌栓發(fā)生中的作用并揭示其發(fā)揮作用的分子機制。探討lncRNA及腫瘤干細(xì)胞作為治療靶點，在肝癌合并門靜脈癌栓治療中應(yīng)用的可能性。
　　研究方法:
　　針對本課題的研究內(nèi)容采用如下研究方法:
　　1.門靜脈癌栓特異表達

4、譜分析。采用cDNA芯片檢測門靜脈癌栓組織及相應(yīng)的肝癌組織的基因表達情況，并利用相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞系進行驗證?；诓町惐磉_基因分析，采用GO富集分析等方法分析門靜脈癌栓組織異常的信號通路，探討門靜脈癌栓發(fā)生的分子機制。
　　2.門靜脈癌栓特異表達lncRNA分子篩選。以cDNA芯片差異表達分析結(jié)果為基礎(chǔ)，采用生物信息學(xué)軟件Blat尋找門靜脈癌栓組織及門靜脈癌栓細(xì)胞系CSQT-2特異高/低表達的lncRNA分子中，同差異mRNA在序列上

5、有相似/互補的lncRNA分子，尋找候選lncRNA分子。
　　3.門靜脈癌栓特異表達lncRNA分子表達驗證。采用SYBRGreen實時定量PCR方法檢測候選lncRNA分子在腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中的表達。RACE-PCR結(jié)合生物信息學(xué)方法分析lncRNA分子的編碼潛能。采用熒光原位雜交方法檢測lncRNA分子在腫瘤細(xì)胞中的分子定位，便于后續(xù)分析其分子功能。
　　4.門靜脈癌栓特異表達lncRNA分子功能分析。采用過表達載

6、體/特異靶向干擾RNA序列(siRNA)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的方法在腫瘤細(xì)胞中上調(diào)/下調(diào)候選lncRNA分子的表達。在調(diào)控表達的基礎(chǔ)上采用增殖/轉(zhuǎn)移等功能實驗，在體外檢測候選lncRNA分子的功能。建立小鼠皮下荷瘤模型在體內(nèi)檢測候選lncRNA分子的功能。
　　5.門靜脈癌栓特異表達lncRNA分子表達調(diào)控機制探討。生物信息學(xué)分析結(jié)合ChIP方法尋找候選lncRNA分子上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。采用過表達載體/siRNA轉(zhuǎn)染方法對轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進行

7、功能獲得/缺失實驗，然后采用SYBRGreen實時定量PCR方法檢測候選lncRNA分子的表達情況，以此來探討候選lncRNA分子表達異常的分子機制。
　　研究結(jié)果
　　cDNA芯片分析發(fā)現(xiàn)門靜脈癌栓組織、肝癌腫瘤組織及癌旁對照各自具有特異的編碼RNA和長鏈非編碼RNA分子表達譜。門靜脈癌栓細(xì)胞系CSQT-2和肝癌腫瘤細(xì)胞系Hep3B也具有特異的編碼RNA和長鏈非編碼RNA分子表達譜。GO富集分析和KEGG信號通路富集分析結(jié)

8、果顯示門靜脈癌栓組織異常表達的基因涉及到氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞增殖、藥物代謝反應(yīng)、細(xì)胞黏附及免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程。腫瘤組織cDNA芯片結(jié)果同腫瘤相關(guān)細(xì)胞系cDNA芯片結(jié)果對比分析發(fā)現(xiàn)有32條lncRNA分子和26條mRNA分子在兩種腫瘤組織和相應(yīng)的腫瘤相關(guān)細(xì)胞系中表現(xiàn)出一致的表達模式。Blat軟件分析發(fā)現(xiàn)這些分子中l(wèi)ncRNA分子LNC24236和ICAM-1 mRNA之間有大約800bp連續(xù)的堿基互補配對。實時定量PCR結(jié)果顯示LNC24

9、236和ICAM-1在門靜脈癌栓組織和細(xì)胞系CSQT-2中的表達水平分別高于對應(yīng)的肝癌組織和肝癌細(xì)胞系Hep3B。
　　在門靜脈癌栓細(xì)胞系CSQT-2和肝癌腫瘤細(xì)胞系(Hep3B、Huh7)中，上調(diào)/下調(diào)ICR的表達水平導(dǎo)致ICAM-1 mRNA和蛋白發(fā)生相應(yīng)的上調(diào)/下調(diào)。肝癌腫瘤細(xì)胞系Hep3B上調(diào)ICR后，其轉(zhuǎn)移能力明顯增強。門靜脈腫瘤細(xì)胞系CSQT-2中下調(diào)ICR后，ICAM-1 mRNA的穩(wěn)定性降低、ICAM-1蛋白表達減

10、少。Hep3B細(xì)胞中上調(diào)ICR后ICAM-1 mRNA的穩(wěn)定性升高、ICAM-1蛋白表達升高。定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)肝癌腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系來源的ICAM-1+腫瘤細(xì)胞中，ICR的表達水平明顯高于相對應(yīng)的ICAM-1-腫瘤細(xì)胞。肝癌腫瘤細(xì)胞中，下調(diào)ICR的表達能夠明顯減少ICAM-1+腫瘤細(xì)胞的比率，降低腫瘤細(xì)胞在體外懸浮培養(yǎng)中生成懸浮球的能力。在腫瘤模型小鼠體內(nèi)，皮下荷瘤原位注射靶向ICR的siRNA表達病毒導(dǎo)致ICR和ICAM-1表達下

11、降、腫瘤組織中ICAM-1+腫瘤細(xì)胞比例降低、腫瘤生長減緩。Nanog能夠結(jié)合到ICR上游DNA序列中。在肝癌細(xì)胞系中上調(diào)/下調(diào)Nanog的表達能夠上調(diào)/下調(diào)ICR的表達水平。
　　結(jié)論
　　肝癌門靜脈癌栓組織具有不同于原發(fā)肝癌腫瘤組織和癌旁對照組織的獨特基因表達譜。lncRNA分子ICR為門靜脈癌栓組織及相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系CSQT-2中特異性表達升高的lncRNA分子。ICR通過與ICAM-1 mRNA分子結(jié)合形成RNA-RN