角膜新生血管相關(guān)的長鏈非編碼RNA(lncRNAs)的鑒定及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：正常的角膜組織沒有血管，周圍血管終止于角膜緣，在角膜緣形成血管網(wǎng)，營養(yǎng)成分由此擴(kuò)散入角膜。無血管化是角膜的主要特征，也是其完全透明，維持正常視力的重要因素。在炎癥、感染、化學(xué)傷、變性等疾病中或由于眼科手術(shù)，維持角膜無血管的平衡因素被破壞，角膜會發(fā)生病理性新生血管，導(dǎo)致角膜喪失透明，從而最終影響視力，同時(shí)角膜新生血管(corneal neovascularization，CN)也是角膜移植手術(shù)發(fā)生排斥的高危因素。長鏈非編碼RNA(l

2、ncRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子，轉(zhuǎn)錄水平低于蛋白質(zhì)編碼基因，具有組織特異性。它們并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控眾多生物學(xué)過程。CN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受到各個(gè)基因?qū)用娴恼{(diào)控，目前對lncRNAs在CN中的研究尚在起步階段，有必要篩選和鑒定與CN有關(guān)的lncRNAs，闡明其作用機(jī)制，為CN的治療提供新的藥物靶點(diǎn)。本論文旨在建立小鼠的新生血管模型，鑒定小鼠新生血

3、管角膜相關(guān)的lncRNAs，并研究其在CN發(fā)生發(fā)展中的潛在的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：建立堿燒傷誘導(dǎo)的小鼠角膜新生血管模型，采用lncRNAs微陣列基因芯片技術(shù)分析lncRNAs在正常角膜和新生血管化角膜(CN)組織的表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)的lncRNAs;根據(jù)Pearson相關(guān)性分析，構(gòu)建lncRNAs/mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò);通過基因本體(GO)的富集分析和pathway分析等生物信息學(xué)技術(shù)，探討lncRNAs/mRNA共表達(dá)基因在角膜

4、新生血管發(fā)生的作用機(jī)制及可能的病理途經(jīng);根據(jù)芯片檢測結(jié)果，篩選了20個(gè)差異表達(dá)顯著的lncRNAs，對兩組角膜樣本用RealTime PCR驗(yàn)證芯片檢測結(jié)果，同時(shí)檢測了抗血管生成因子（PDGF和endostadin）和促血管生成因子（VEGF及iNOS）的表達(dá)，分析這些相關(guān)的lncRNAs的表達(dá)規(guī)律。分別選取差異表達(dá)最顯著的上調(diào)、下調(diào)lncRNAs作為研究靶點(diǎn)，臨床采集角膜炎、化學(xué)傷、外傷患者的角膜樣本，采用RealTime-PCR，對

5、篩選出的角膜新生血管相關(guān)的靶點(diǎn)lncRNAs進(jìn)行表達(dá)分析驗(yàn)證，同時(shí)檢測樣本促血管生長因子（VEGF，Ang-2，MMP-9）和抗血管生長因子(PDGF)的表達(dá)，并與上述兩條靶點(diǎn)lncRNAs的表達(dá)趨勢進(jìn)行比較，分析這兩條相關(guān)lncRNAs的表達(dá)規(guī)律。利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)，通過設(shè)置空白對照組、h2o2組、H2O2+Scr siRNA組和H2O2+NR-033585siRNA組，分別進(jìn)行Hoechst33342染色、JC-1

6、染色、PI染色和Ki67檢測，判斷在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，人同源lncRNAs NR_033585對(HUVEC)活力、增殖的影響，在分子水平探討其潛在的調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果：動物模型中，通過lncRNAs基因芯片技術(shù)，分析CN組和正常組樣品的lncRNAs表達(dá)譜，篩選差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)并且變化倍數(shù)在3.0倍以上的lncRNAs，共計(jì)154條，其中下調(diào)的共60條，上調(diào)的共94條。GO分析是根據(jù)基因本體論，將基因分成三類:生

7、物學(xué)進(jìn)程類，細(xì)胞組分類，分子功能類。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高富集lncRMAs/mRNA共表達(dá)基因，在細(xì)胞外區(qū)（本體:細(xì)胞組分類），DNA結(jié)合（本體論:分子功能類），和免疫反應(yīng)（本體論:生物學(xué)進(jìn)程類）。GO富集分析提示CN的生物學(xué)行為發(fā)生在細(xì)胞外區(qū)，與DNA結(jié)合并發(fā)生免疫反應(yīng)。KEGG數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示lncRNAs潛在的靶基因mRNA可能參與多個(gè)信號通路，如癌癥信號通路，MAPK信號通路，鈣信號通路，神經(jīng)活性的配體受體相互作用，縫隙連接，Toll

8、樣受體信號通路和Wnt信號通路。通路分析表明“癌癥通路”基因富集度最高，提示CN的信號通路與癌癥的信號通路有一定的相似性。對篩選出的20條差異表達(dá)顯著的lncRNAs，qRT-PCR驗(yàn)證其中17條的表達(dá)水平與芯片檢測結(jié)果相一致，上調(diào)的lncRNAs與促血管生長因子(VEGF及iNOS)的表達(dá)趨勢一致，下調(diào)的lncRNAs與抗血管生長因子(PDGF，endostadin)的表達(dá)趨勢一致。臨床采集角膜炎、化學(xué)傷、外傷患者角膜樣本，分別選取差

9、異表達(dá)最顯著的上調(diào)、下調(diào)lncRNAs作為研究靶點(diǎn)（上調(diào)最顯著:人同源NR033585;下調(diào)最顯著:人同源chr8:129102060-129109035A反鏈），對上述臨床采集的角膜樣本進(jìn)行Real Time-PCR檢測，對篩選出的角膜新生血管相關(guān)的靶點(diǎn)lncRNAs進(jìn)行表達(dá)分析驗(yàn)證，同時(shí)檢測樣本促血管生長因子（VEGF，Ang-2，MMP-9）和抗血管生長因子(PDGF)的表達(dá)，并與上述兩條靶點(diǎn)lncRNAs的表達(dá)趨勢進(jìn)行比較，分析