Ipro1-PPE68 DNA疫苗的構(gòu)建及誘導(dǎo)BALB-c小鼠免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建pBud-Iprl-PPE68-OriM穿梭質(zhì)粒，觀察鼠胞內(nèi)抗性基因1(intracellular pathogen resistance1，Ipr1)和PPE68基因在鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7內(nèi)的表達(dá)。并將Ipr1/PPE68 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，探討其誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答的情況。
　　方法：
　　1、Ipr1基因、PPE68抗原編碼序列分別插入pBudCE4.1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)酶切測

2、序鑒定后，構(gòu)建pBud68-Ipr1質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞株RAW264.7，通過RT-PCR Western Blot檢測Ipr1和PPE68蛋白的表達(dá)。結(jié)核分枝桿菌的復(fù)制子(Mycobacterium tuberculosisorigin of replication，OriM)的編碼序列分別插入到pBud68-Ipr1質(zhì)粒的Nhe1位點(diǎn)，構(gòu)建pBud-Ipr1-PPE68-OriM穿梭質(zhì)粒。
　　2、pBud-Ipr1-P

3、PE68-OriM穿梭質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，在末次免疫后2周，ELISA法檢測小鼠體內(nèi)的lgG2a、IL-12以及IFN-γ的表達(dá)水平，MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖的情況，流式細(xì)胞儀檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)通過病理切片觀察BALB/c小鼠肺脾組織的病理變化。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)過酶切測序鑒定pBud-Ipr1-PPE68-OriM穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功，RT-PCR、Western-Blotting鑒定Ipr

4、1和PPE68蛋白在巨噬細(xì)胞株RAW264.7表達(dá)成功。
　　2、pBud-Ipr1-PPE68-OriM穿梭質(zhì)粒免疫后的BALB/c小鼠血清內(nèi)的lgG2a、IL-12、IFN-γ以及CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量都表現(xiàn)出了有意義的提高。脾淋巴細(xì)胞的增殖水平與BCG相比沒有區(qū)別。肺脾組織均未觀察到病理學(xué)變化。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了pBud-Ipr1-PPE68-OriM穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞株RAW264.