旋毛形線蟲預(yù)感染對夏氏瘧原蟲感染BALB-c小鼠免疫應(yīng)答的影響及機制的研究.pdf

1、目的:
　　 瘧疾是瘧原蟲通過媒介按蚊傳播的人類最為嚴重的寄生原蟲感染性疾病，2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)已將瘧疾作為優(yōu)先重點防治的感染性疾病?！妒澜绡懠矆蟾?012》公布的最新數(shù)據(jù)顯示，目前全球有2.19億瘧疾病例，2010年因瘧疾死亡的人數(shù)為66萬，104個國家和地區(qū)有瘧疾流行的報告。我國也制定了“十二五”期間在中國境內(nèi)消滅瘧疾的宏偉計劃。因此，抗瘧研究已經(jīng)成為當今世界迫切需要解決的重點課題。瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一

2、樣，需要通過免疫效應(yīng)機制對其控制和消除，免疫應(yīng)答的時效與強度影響宿主感染瘧原蟲的感染模式與結(jié)局。大量的研究數(shù)據(jù)顯示，在瘧疾流行區(qū)，混合感染現(xiàn)象普遍存在，從而影響宿主的感染模式和結(jié)局。較常見的有瘧原蟲與HIV、蠕蟲或結(jié)核分枝桿菌的混合感染。因此，探討瘧疾流行區(qū)病原體之間的相互作用特點，特別是病原體對瘧疾免疫應(yīng)答的影響及其相關(guān)機制無疑將為揭示瘧疾流行區(qū)病原體相互作用的細胞和分子機制提供新的理論依據(jù)，進一步充實對瘧疾免疫的認識。
　　

3、 本研究用旋毛形線蟲小鼠模型再感染瘧原蟲，動態(tài)觀察旋毛形線蟲混合感染對瘧疾感染進程與最終結(jié)果的影響，并著重探討T細胞在感染過程中的變化以及這些變化對宿主免疫力和預(yù)后的影響，旨在進一步揭示旋毛形線蟲與瘧原蟲共同感染的相關(guān)細胞和分子機制，以期為瘧疾流行區(qū)新的防控策略的確定提供新的思路。
　　 方法:
　　 1、實驗動物及其模型建立
　　 54只雄性BALB/c小鼠隨機分為3組，每組18只。實驗組小鼠(TPC)經(jīng)口感染

4、300只旋毛形線蟲，并于感染后的1w(TPC1)、3w(TPC3)經(jīng)腹腔感染1×106夏氏瘧原蟲寄生的紅細胞，構(gòu)建混合感染模型。對照組(PC)在同一時間點單純感染夏氏瘧原蟲。
　　 2、原蟲血癥檢測及體重觀察
　　 混合感染模型制備成功后，每天隨機取3只小鼠，經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯徼鏡檢計數(shù)紅細胞感染率并記錄小鼠體重變化。
　　 3、脾細胞熒光抗體染色
　　 無菌取出感染前(0d)

5、和感染后5d、10d、15d小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細胞終濃度為1×107/ml。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1mL，每份樣品加入抗-CD4-FITC單抗進行表面染色，另設(shè)陰性對照管。固定透膜后，用抗-IFN-γ-PE單抗、抗-Gata-3-PE單抗進行胞內(nèi)染色。用含1％FCS的PBS洗

6、滌兩次并懸浮于500μl PBS中，流式細胞儀(BectonDickinson，USA)進行檢測。每份樣品用抗-CD4-FITC和抗-CD25-PE單抗進行表面染色，固定透膜后，用抗-Foxp3-APC單抗進行胞內(nèi)染色，用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μl PBS中，流式細胞儀進行檢測。
　　 4、IFN-γ、IL-4及IL-10定量檢測
　　 用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ\

7、 IL-4及IL-10的分泌水平。操作過程按照試劑盒說明書進行操作，酶標儀測定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，應(yīng)用SoflMax Pro4.3.1Ls軟件分析，計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　 5、血清特異性抗體檢測
　　 于感染前(0d)和感染后5d、10d、15d采集小鼠眼球血于1.5 ml離心管中，收集瘧原蟲并制備抗原包被酶標板，100μl/孔，4℃過夜，5％FCS封閉1h，洗滌后加

8、入1∶200稀釋的血清，37℃2h。洗滌后加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶500)100μl/孔，37℃1h，洗滌。然后加入OPD-H2O2底物顯色，15 min，2M H2SO4終止反應(yīng)，用酶標儀測定波長490nm處的OD值。
　　 6、轉(zhuǎn)錄因子分析
　　 (1) RNA提取及cDNA合成
　　 采用Trizol一步法提取脾細胞總RNA，用紫外分光光度計測定RNA的含量。用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)

9、錄為cDNA后，置-20℃保存。
　　 (2)引物設(shè)計
　　 通過Primer5.0在線軟件設(shè)計Gata-3，T-bet以及GAPDH實時定量PCR引物序列。
　　 (3)熒光定量PCR檢測T-bet及Gata-3 mRNA表達水平
　　 利用SYBR GreenⅡ染料進行各基因的實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系20μL，共40個循環(huán)。為消除樣本處理、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)差異，每個樣品GAPDH、Gata-3及T-

10、bet基因同時檢測3次，取平均值。
　　 7、統(tǒng)計學分析
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標本采用獨立樣本t-檢驗比較分析組內(nèi)和組間均值差異。P小于0.05為差異顯著。
　　 結(jié)果:
　　 1、混合感染模型的鑒定
　　 旋毛形線蟲感染8w后將全部小鼠引頸處死，取一小塊膈肌壓片鏡檢觀察，證實小鼠均成功感染旋毛形線蟲。
　　 2、原蟲血癥檢測及體重觀察
　　 與PC組

11、相比，TPC1組感染后第3d，小鼠的外周血中出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細胞。隨后，BALB/c小鼠原蟲血癥迅速上升，至感染后9d達到峰值后迅速下降，PC組峰值為40.15％，TPC1組為33.4％（峰值降低）。TPC3組于感染后第5d檢測出原蟲血癥，原蟲血癥出現(xiàn)時間推遲，至感染后13d達到峰值44.55％（峰值升高），TPC組與PC組均與感染后21d左右自愈。TPC組與PC組相比體重均下降。
　　 3、旋毛形線蟲與鼠瘧原蟲共同感染小鼠脾

12、細胞懸液細胞數(shù)量檢測
　　 (1) CD4+IFN-γ+T細胞數(shù)量檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、10d，PC組小鼠CD4+IFN-γ+T細胞均出現(xiàn)明顯增加。TPC1組小鼠于感染后第5d，CD4+IFN-γ+T細胞數(shù)量顯著高于PC組小鼠。然而，TPC3組與PC組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 (2) CD4+Gata-3+T細胞數(shù)量檢測
　　 與感染前相比，感染后第10d，PC組小鼠CD4+Gata-3

13、+T細胞出現(xiàn)明顯增加。TPC3組小鼠于感染后第10d，CD4+Gata-3+T細胞數(shù)量顯著高于PC組小鼠。然而，TPC1組與PC組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 (3) CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數(shù)量檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、10d，PC組小鼠Treg細胞出現(xiàn)明顯增加。TPC1組小鼠于感染前及感染后第5d，Treg細胞數(shù)量顯著低于PC組小鼠。然而，TPC3組與PC組相比無統(tǒng)計學差異。
　　

14、 4、旋毛形線蟲與鼠瘧原蟲共同感染小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子檢測
　　 (1)IFN-γ水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d，PC組小鼠脾細胞IFN-γ分泌出現(xiàn)明顯增加。TPC1組小鼠于感染后第5d，IFN-γ分泌水平顯著高于PC組小鼠。然而，TPC3組小鼠于感染后第5d，IFN-γ分泌水平顯著低于PC組小鼠。
　　 (2)IL-4水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、10d、15d，PC組

15、小鼠脾細胞IL-4分泌出現(xiàn)明顯增加。TPC3組小鼠于感染后第5d、10d，IL-4分泌水平顯著高于PC組。然而，TPC1組與PC組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 (3)IL-10水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、10d、15d，PC組小鼠脾細胞IL-10分泌出現(xiàn)明顯增加。 TPC1組小鼠于感染后第5d，IL-10分泌水平顯著低于PC組。然而，TPC3組與PC組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 5、小鼠血清IgG水平檢

16、測
　　 與感染前相比，感染后第10d、15d，PC組小鼠血清中的特異性IgG出現(xiàn)了有意義的升高。 TPC3組小鼠于感染前及感染后第5d，IgG表達水平顯著高于PC組。然而，TPC1組與PC組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 6、旋毛形線蟲與鼠瘧原蟲共同感染小鼠脾細胞懸液中轉(zhuǎn)錄因子檢測
　　 (1) T-bet水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d、15d，PC組小鼠T-bet表達出現(xiàn)明顯增加。TPC1組小鼠

17、于感染后第5d，T-bet表達水平顯著高于PC組。然而，TPC3組與PC組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 (2) Gata-3水平檢測
　　 與感染前相比，感染后第5d，PC組小鼠Gata-3表達出現(xiàn)明顯增加。TPC3組小鼠于感染后第5d，Gata-3表達水平顯著高于PC組。然而，TPC1組與PC組相比無統(tǒng)計學差異。
　　 (3) T-bet與Gata-3表達水平的比值
　　 與感染前相比，PC組小鼠于感染后第

18、5d，T-bet/Gata-3比值達到峰值，于感染后第10d迅速下降至最低點，隨后于感染后第15d再次升高。TPC1組小鼠T-bet/Gata-3比值顯著高于PC組。然而，TPC3組小鼠T-bet/Gata-3比值顯著低于PC組。
　　 結(jié)論:
　　 1、不同時相旋毛形線蟲與夏氏瘧原蟲共同感染BALB/c小鼠，其免疫應(yīng)答模式存在差異。
　　 2、不同時相旋毛形線蟲混合感染改變宿主對瘧原蟲的抗感染能力，但混合感染并