香菇多糖對約氏瘧原蟲感染BALB-c小鼠紅內(nèi)期免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?香菇多糖(Lentinan，Lent)是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，它能廣泛地提高機(jī)體免疫防御的能力，增強(qiáng)宿主對病毒、細(xì)菌、真菌以及寄生蟲等的抗感染能力，同時(shí)還具有抗腫瘤作用。目前研究表明，香菇多糖激發(fā)的抗感染免疫保護(hù)性機(jī)制依賴于輔助宿主誘導(dǎo)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，它能顯著活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)一氧化氮(NO)生成和淋巴細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)干擾素或白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此香菇多糖被稱為“巨噬細(xì)胞參與的T細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑”。

2、 瘧疾是瘧原蟲通過蚊傳播的嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病。《Nature》公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，世界上100多個(gè)國家為瘧疾流行區(qū)，約22億人口受到瘧疾的威脅，每年有300-500萬瘧疾臨床病例，病人死亡人數(shù)高達(dá)110-270萬[1]。然而，由于瘧原蟲對氯喹等抗瘧藥產(chǎn)生抗藥性，瘧防措施已面臨著嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，迫切需要研制新的瘧疾疫苗和瘧疾防治方法以控制這種傳染病的流行。 不斷積累的研究數(shù)據(jù)表明，以IFN—γ顯著升高為特征的Th1免疫應(yīng)

3、答的有效建立是保護(hù)性免疫效應(yīng)發(fā)揮的關(guān)鍵因素。同種或異種瘧原蟲感染不同遺傳背景小鼠，其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答具有明顯的差異性。在致死性鼠瘧感染時(shí)Th1免疫應(yīng)答無法有效建立與紅內(nèi)期CD4+CD25+調(diào)節(jié)性細(xì)胞(Tregs)的過早活化有關(guān)。Tregs作為一組具有免疫調(diào)控作用的重要細(xì)胞群，以細(xì)胞間直接接觸和分泌IL-10或TGF-β等細(xì)胞因子等方式發(fā)揮抑制性免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。最近一項(xiàng)研究指出瘧疾感染早期變異瘧原蟲與DCs通過TLR9依賴途徑激活Tregs，

4、而且通過分泌IL-10和誘導(dǎo)CD4+T凋亡實(shí)現(xiàn)免疫逃避。 為了研究香菇多糖對致死性鼠瘧感染紅內(nèi)期免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用香菇多糖預(yù)處理致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XL，Py17XL)感染BALB/c小鼠，動(dòng)態(tài)觀察感染早期感染BALB/c小鼠Th1免疫應(yīng)答的差異；Tregs細(xì)胞數(shù)量的變化和功能特點(diǎn)；脾樹突細(xì)胞表面分子的表達(dá)和分泌細(xì)胞因子的情況，以期闡明香菇多糖對致死性鼠瘧感染紅內(nèi)期免疫應(yīng)答

5、的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制，從而為瘧疾疫苗的研制和防治提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其模型構(gòu)建 6—8周齡、雌性BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔接種1×106 p.y17XL寄生的紅細(xì)胞，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 2、采用雙抗體夾心ELISA法及Griess反應(yīng)檢測Py17XL感染的BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-12、IFN—γ、NO2—的含量。 3、采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測Py17XL感染的BA

6、LB/c小鼠脾Tregs及CD4+T細(xì)胞凋亡百分比 無菌取出感染早期小鼠脾臟，制成1×107/ml脾細(xì)胞懸液。每份樣品用抗CD4—FITC單抗和抗CD25-PE單抗進(jìn)行雙色分析，另設(shè)陰性對照管。流式細(xì)胞儀專用染色管預(yù)先加人FcγⅢ/Ⅱ受體抗體2μl，取新鮮制備的1×107/ml脾細(xì)胞懸液0.1ml，再加人抗CD4—FITC單抗、抗CD25-PE單抗各0.2μg。振蕩器低速混勻，冰浴放置，避光反應(yīng)30min。每管加入2ml含2％

7、FCS的PBS，水平轉(zhuǎn)頭離心機(jī)300g，離心5min，棄上清，洗滌兩次。每管加入500μ12％多聚甲醛固定液重懸，靜置15 min上機(jī)。 4、采用雙抗體夾心ELISA法檢測Py17XL感染的BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制性細(xì)胞因子IL-10的含量。 5、流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測CD11c+DCs表面MHC—Ⅱ分子、協(xié)同共刺激分子(CD80、CD86)和TLRs(TLR—2、TLR4)的表達(dá)情況；雙抗體夾心ELISA法檢測

8、CD11c+DCs分泌的IL-12的含量 小鼠無菌摘取脾臟，用10ml含5％熱滅活FCS的RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，350×g，室溫離心10min。經(jīng)0.17mol/L NH4CL裂解紅細(xì)胞、RPMI1640洗滌2次，用完全RPMI1640培養(yǎng)液(含10％熱滅活的胎牛血清，1％L—谷氨酸鹽，25μg/ml慶大霉素和5×10-5M2—巰基乙醇)調(diào)整脾細(xì)胞終濃度至1×107/ml，24孔培養(yǎng)板，每孔都加入500μl細(xì)胞懸液

9、(約含5×105/ml DCs)和500μl pRBC，然后分別加入10μl LPS(0.5mg/ml)、10μl Lent(1mg/10ml)和2μl Lent(5mg/10ml)，各組一式6孔，取其中3孔培養(yǎng)24h，待流式檢測；另3孔培養(yǎng)48h，350×g室溫離心10min，收集上清，—80℃保存，待細(xì)胞因子測定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、感染的BALB/c小鼠原蟲血癥水平及其生存率 為了研究香菇多糖對p.y17XL

10、感染BALB/c小鼠感染進(jìn)程和感染結(jié)局的影響，本實(shí)驗(yàn)觀察了香菇多糖對BALB/c小鼠的蟲血癥和生存率的作用。pre—15d Lent組感染小鼠原蟲血癥上升緩慢，于感染后第8d僅達(dá)到20％左右，隨后緩慢下降，于感染后第15d小鼠痊愈；pre—6d Lent組小鼠于感染后第5d原蟲血癥僅達(dá)到約28％，隨后緩慢下降，至感染后第17d原蟲血癥消失，小鼠生存率為66.7％。Lent組小鼠原蟲血癥上升緩慢，于感染后第7d出現(xiàn)第一次原蟲血癥高峰(40

11、％)，至感染后第9d降至30％，隨后于感染后第10d再次迅速升高至50％左右，小鼠全部死亡，但生存期明顯延長。 2、感染的BALB/c小鼠Th1免疫應(yīng)答 IL-12是一種T細(xì)胞應(yīng)答的重要刺激因子，而且與先天性免疫和適應(yīng)性免疫密切相關(guān)。瘧原蟲感染早期Control組小鼠IL-12分泌水平于感染后第1d達(dá)峰值，隨后迅速下降pre—15d Lent組、pre—6d Lent組小鼠瘧原蟲感染早期IL-12分泌水平顯著高于Con

12、trol組(P<0.01)；而Lent組小鼠能顯著上調(diào)感染后1d、3d的IL-12的水平(P<0.05)。感染小鼠IFN—γ分泌水平在感染后第3d達(dá)峰值，隨后迅速降低。如圖(Fig．2B)所示，pre—15d Lent組小鼠感染后IFN—γ水平顯著高于Control組，pre—6d Lent組小鼠于感染后第3d、5d IFN—γ水出現(xiàn)有意義的升高(P<0.01)；與Control組相比，Lent組小鼠僅于感染后第3d IFN—γ水平有顯

13、著性差異(P<0.05)。我們?nèi)∮酶腥綛ALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清，并測量了其中亞硝酸根的濃度，它是一氧化氮合成量的標(biāo)識。與Control組相比，Lent不同處理組小鼠于感染后第1d和3d，IL-12水平均出現(xiàn)有意義的升高(P<0.01)；pre—15d Lent組，于感染后第5d仍具有顯著性差異(P<0.05)。 3、感染的BALB/c小鼠Tregs應(yīng)答 Control組小鼠瘧原蟲感染后Tregs數(shù)量迅速增加，并于

14、感染后第5d達(dá)峰值。pre—15d Lent組和pre—6d Lent組小鼠Tregs數(shù)量在感染后第3d和5d一直保持下降趨勢(P<0.05)，但Lent組感染小鼠Tregs數(shù)量未見有意義的變化。Control組感染小鼠CD4+T細(xì)胞凋亡數(shù)量均呈升高趨勢，并于感染后第5d達(dá)峰值。pre—15d Lent組和pre—6d Lent組小鼠感染后第3d和5d CD4+T細(xì)胞凋亡數(shù)量呈顯著性減少(P<0.05)，但Lent組小鼠CD4+T細(xì)胞凋

15、亡數(shù)量未見有意義的變化。感染小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10分泌水平在感染后第3d達(dá)峰值。pre—15d Lent組小鼠IL-10分泌水平顯著減少，而pre—6d Lent組小鼠在感染后第1d、3d IL-10分泌水平也呈下降趨勢(P<0.01)，但Lent組小鼠IL-10分泌水平無明顯變化。 4、CD11c+DCs表面分子的表達(dá)及其分泌的細(xì)胞因子 香菇多糖與BALB/c小鼠脾細(xì)胞和pRBC(感染紅細(xì)胞)共同培養(yǎng)24h后，

16、發(fā)現(xiàn)Lent(5mg/ml)能夠上調(diào)小鼠DCs表面的MHC—Ⅱ、CD80和CD86分子表達(dá)(P<0.05)，而且Lent(5mg/ml)還能高表達(dá)CD11c+DCs表面的TLR2、TLR4(P<0.05)。IL-12是DCs受刺激后比較特異的一種產(chǎn)物，ELISA結(jié)果顯示Lent(5mg/ml)能夠刺激CD11c+DCs分泌高水平的IL-12(P<0.05)，綜合香菇多糖能夠誘導(dǎo)CD11c+DCs表面高表達(dá)MHC—Ⅱ和協(xié)同刺激分子的實(shí)驗(yàn)結(jié)

17、果，充分證明香菇多糖能夠促進(jìn)DCs功能的成熟。 結(jié)論： 1、香菇多糖通過增加IL-12、IFN—γ、NO的分泌水平有效激發(fā)Py17XL感染的BALB/c小鼠Th1免疫應(yīng)答的建立。 2、香菇多糖通過降低Tregs數(shù)量、凋亡CD4+T細(xì)胞數(shù)量以及減少IL-10的分泌水平抑制Tregs應(yīng)答。 3、香菇多糖通過激發(fā)CD11c+DCs表面的TLR2/TLR4信號途徑刺激特異性CD4+T細(xì)胞的增殖和功能，并上調(diào)CD1