化香樹果序醇提物誘導人鼻咽癌細胞發(fā)生methuosis死亡的機制研究.pdf

1、背景:
　　鼻咽癌起源于人鼻咽部粘膜上皮和腺體的惡性腫瘤，發(fā)病人群主要分布于中國華南地區(qū)，廣東省人數尤其較多，因此又稱為“廣東癌”。目前，鼻咽癌的臨床治療主要以放療、化療為主，但這兩種方法副作用較大且有約30％的患者即使運用這兩種方法進行綜合治療，5年生存率仍較低。
　　近年來研究發(fā)現，多種中藥具有抗腫瘤作用，且以放化療為主、中藥為輔的綜合治療方案能在一定程度上提高腫瘤患者的5年生存率。因此，中藥被認為是一種治療腫瘤的有效輔

2、助藥物?；銟涔蚴且环N主要產于華南和西南各省的中藥材。既往研究表明，其水煎物對人鼻咽癌細胞CNE2具有細胞毒性作用，但具體藥理機制尚未闡明。
　　Methuosis死亡的發(fā)生機制尚未完全闡明，目前部分研究認為methuosis死亡是macropinocytosis過程出現異常時發(fā)生的一種細胞死亡方式。在藥物和外界刺激下，macropinosomes會在細胞內大量積累，彼此相互融合逐步形成更大的液泡，同時細胞核不會發(fā)生明顯改變，隨

3、后細胞代謝活動會逐漸減少，細胞膜發(fā)生破裂，最終細胞死亡。Methuosis細胞死亡方式的發(fā)現可為對抗凋亡藥物耐藥的惡性腫瘤患者提供新的治療途徑。
　　此前，課題組通過體內外實驗證實，化香樹果序醇提物(Alcohol extract of Platycarya strobilacea sieb.et Zucc，PSZ)能抑制CNE1和CNE2增殖并誘導其發(fā)生methuosis死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。目前，國內外對methuosis死亡

4、發(fā)生的具體機制仍未有明確的闡述。本研究旨在前期研究基礎上進一步探究化香樹果序醇提物誘導人鼻咽癌細胞發(fā)生methuosis死亡的相關信號通路，并初步篩選methuosis死亡發(fā)生過程中的關鍵靶點，為中藥治療惡性腫瘤提供實驗室依據。
　　目的:
　　研究化香樹果序醇提物誘導人鼻咽癌細胞發(fā)生methuosis細胞死亡的范圍及methuosis死亡發(fā)生的相關信號通路，同時初步篩選導致該死亡方式發(fā)生的關鍵靶點。
　　方法:

5、>　　第1部 分化香樹果序生藥材的提取工藝及其主要成分分析
　　用乙醇回流方法提取化香樹果序生藥材，隨后濃縮、干燥藥物，利用高效液相色譜技術(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析醇提物的主要成分。
　　第2部分 檢測化香樹果序醇提物對不同病理類型人鼻咽癌細胞的作用效果
　　取對數生長期的SUNE1、CNE1、CNE2和5-8F細胞分別接種于6孔培養(yǎng)板（1.2×10

6、5cells/ml，2ml/孔），細胞培養(yǎng)箱孵育24h后分別進行相應處理，倒置顯微鏡下觀察細胞在4h、8h、12h、24h、48h這5個時間點的形態(tài)學改變。
　　第3部分 化香樹果序醇提物誘導人鼻咽癌細胞發(fā)生methuosis死亡的機制研究
　　3.1 生物信息學分析
　　在本課題組前期全基因組測序的基礎上，結合相關文獻，利用KEGG數據庫篩選與methuosis死亡相關的信號通路。
　　3.2 熒光實時定量PC

7、R(Real-time qPCR)檢測各組相關基因的表達水平
　　化香樹果序醇提物(1.0mg/m)干預24h后，分別提取各組RNA，逆轉錄，擴增，RT-qPCR比較H-Ras、Arf6、Rac1、MAPK1、MAPK3和FOS六個相關基因的表達差異。
　　3.3 Western Blot檢測H-Ras和Rac1蛋白的表達水平
　　化香樹果序醇提物（1.0mg/m）干預24h后，提取各組細胞總蛋白，Bicinchoni

8、nic acid(BCA)法蛋白定量檢測，Westem Blotting(WB)測定細胞內H-Ras和Rac1蛋白的表達水平。
　　3.4 Rac1抑制劑EHT1864干預實驗
　　將處于對數生長期的CNE1和CNE2細胞分別接種于6孔培養(yǎng)板(1.2×105cells/ml，2ml/孔)，細胞箱孵育24h后分別進行相關藥物處理，倒置顯微鏡下觀察細胞在4h、8h、12h、24h、48h各時間點的形態(tài)學改變。
　　統(tǒng)計學分

9、析:
　　本課題組實驗數據均采用IBM SPSS Statistics20.0軟件進行分析，實驗結果中的計量資料以均數±標準差(x±s）表示，兩組比較時如果方差齊用t檢驗，方差不齊用秩和檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。作圖由GraphPad Prism6.0軟件提供。
　　結果:
　　1.本次實驗化香樹果序醇提物出膏率為4.1％?；銟涔虼继嵛锏闹饕煞趾S酮類物質，與課題組前期實驗結果相同。
　　2.

10、化香樹果序醇提物在1.0mg/ml濃度下可誘導人鼻咽癌細胞株SUNE1、CNE1和CNE2細胞內出現大量空泡，空泡不斷相互融合、增大，細胞膜相互融合，最后細胞破裂，此期間細胞核無明顯改變。同時，5-8F細胞相同條件下加入1.0mg/ml濃度的化香樹果序醇提物未發(fā)生明顯的細胞形態(tài)學改變。
　　3.根據KEGG數據庫找到可能與methuosis死亡方式的發(fā)生有關的H-Ras/Arf6/Rac1信號通路。
　　4.RT-qPCR結

11、果顯示，化香樹果序醇提物干預后CNE1和CNE2細胞中H-Ras、Rac1和MAPK1基因表達量增加，Arf6、MAP K3和FOS基因表達量降低。
　　5.Western Blotting結果表明經化香樹果序醇提物處理后CNE1、CNE2細胞中H-Ras和Rac1蛋白表達量均增加。
　　6.Rac1蛋白抑制劑EHT1864干預下，加了1.0mg/ml化香樹果序醇提物的CNE1、CNE2細胞不再發(fā)生methuosis死亡。<

12、br>　　結論:
　　1.乙醇回流法能夠得到成分穩(wěn)定的化香樹果序醇提物，該方法為一種潛在的可批量工業(yè)化生產香樹果序有效藥物成分的技術。
　　2.化香樹果序醇提物在1.0mg/ml濃度下時可誘導人鼻咽癌SUNE1、CNE1和CNE2細胞株發(fā)生methuosis死亡，但不能誘導5-8F細胞株發(fā)生methuosis死亡。
　　3.化香樹果序醇提物誘導人鼻咽癌細胞發(fā)生methuosis死亡的機制可能是通過調控RAS/Arf6/