序貫調(diào)控165hVEGF165-Ang-1基因表達(dá)對(duì)兔缺血心肌新生血管成熟及心功能的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)研究為深入了解序貫調(diào)控hVEGF165/Ang-1基因表達(dá)誘導(dǎo)缺血心肌血管生成的作用和相關(guān)機(jī)制，提高基因治療應(yīng)用的安全性、有效性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；同時(shí)，對(duì)進(jìn)一步完善聯(lián)合基因治療缺血心臟病亦具有重要的理論意義及應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：成年日本大耳白兔，于冠狀動(dòng)脈左室前降支中下1/3交界處結(jié)扎，建立兔心肌梗死動(dòng)物模型，在此模型的基礎(chǔ)上，以2型重組腺相關(guān)病毒(rAAV2)為載體，將9HRE（低氧反應(yīng)元件）調(diào)控的hVEGF16

2、5（人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）及Tet-on-Advanced調(diào)控的Ang-1（血管生長(zhǎng)素-1）采用心肌直接注射方法轉(zhuǎn)染兔梗死心肌，通過(guò)特定時(shí)間點(diǎn)體外主動(dòng)給予強(qiáng)力霉素(Doxcycline， Dox)，觀察兩系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)染hVEGF165與Ang-1基因的表達(dá)調(diào)控作用，檢測(cè)序貫調(diào)控hVEGF165與Ang-1基因表達(dá)對(duì)缺血心肌新生血管成熟及心臟功能的影響。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為8組：A組（雙基因序貫調(diào)控組）：同期轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE- hVEGF165、

3、rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1混合液（混合比例為4：1：4），基因轉(zhuǎn)染6周后靜脈給予DOX誘導(dǎo)Ang-1表達(dá)。B組（雙基因非序貫調(diào)控組）：同期轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE-hVEGF165、rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1混合液(混合比例為4：1：4)，術(shù)后立即靜脈給DOX誘導(dǎo)Ang-1表達(dá)。C組（hVEGF165組）：?jiǎn)为?dú)轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE-hVEGF165。

4、D組（Ang-1組）：?jiǎn)为?dú)轉(zhuǎn)染rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1（混合比例為1:4），術(shù)后立即靜脈給DOX誘導(dǎo)Ang-1表達(dá)。E組（溶劑對(duì)照組）：梗死區(qū)域注射等量生理鹽水，不予DOX誘導(dǎo)。F組（載體對(duì)照組）同期轉(zhuǎn)染rAAV-TRE-Tight-luciferase、rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-9HRE-LacZ混合液（混合比例為4:1：4），轉(zhuǎn)染后處理同A組。G組（假手術(shù)組）開(kāi)胸，在左前降

5、支中下1/3交界處穿線但不結(jié)扎，不予DOX誘導(dǎo)。H組（正常對(duì)照組）未開(kāi)胸正常兔。
　　 通過(guò)肉眼觀察、心電圖描記、HE染色和Masson三色染色驗(yàn)證心肌梗死模型建立成功。采用Western blot方法檢測(cè)hVEGF165和Ang-1基因的表達(dá)。通過(guò)血管滲透性和FITC-Lectin灌注方法檢測(cè)新生血管的功能。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)評(píng)估心臟功能。
　　 結(jié)果：
　　 1．兔心肌梗死模型建立及檢測(cè)結(jié)果：
　　 采用

6、結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支中下1/3交界處的方法建立了兔心肌梗死模型，肉眼觀察可見(jiàn)結(jié)扎點(diǎn)下方心尖部及部分左室前壁心肌顏色由紅色變?yōu)樽仙娣e約15mm×15mm，中心缺血區(qū)周邊部出現(xiàn)暗紅色充血帶。心電圖顯示，術(shù)后ST段弓背向上抬高，表明血管結(jié)扎完全，心肌梗死模型建立成功。肉眼觀察梗死區(qū)形成白色瘢痕組織。HE染色結(jié)果顯示，缺血梗死區(qū)的心肌細(xì)胞排列不齊，肌細(xì)胞數(shù)量減少，心肌細(xì)胞溶解后空泡形成，纖維化，梗死區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson三色染色示

7、，正常心肌纖維呈紅色，梗死區(qū)瘢痕膠原纖維呈藍(lán)色。
　　 2.Westernblot檢測(cè)結(jié)果：
　　 序貫組與溶劑對(duì)照組梗死區(qū)心肌組織均可檢測(cè)到hVEGF165蛋白表達(dá)，梗死形成初期表達(dá)即開(kāi)始增加，6周時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰，此后表達(dá)量逐漸下降，12周時(shí)接近基礎(chǔ)值。與溶劑對(duì)照組相比，序貫組hVEGF165蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 序貫組與溶劑對(duì)照組梗死區(qū)心肌組織均可檢測(cè)到Ang-1蛋白

8、表達(dá)，在模型建立后0,2,4,6周表達(dá)量極低，8,10，12周表達(dá)量增加。與溶劑對(duì)照組相比，心肌缺血后8,10和12周，序貫組Ang-1蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3．新生血管滲透性檢測(cè)結(jié)果：
　　 12周肉眼觀察可見(jiàn)各結(jié)扎組心臟在梗死邊緣區(qū)及病毒注射部位均有少量藍(lán)色染料殘留。序貫組心臟梗死面積較小，有少量經(jīng)血管滲出并殘留于組織內(nèi)的染料。hVEGF165組心臟可見(jiàn)大片染料殘留。溶劑對(duì)照有

9、少量染料殘留，與序貫組相比無(wú)明顯差別。正常心臟基本無(wú)染料殘留。
　　 單位重量心肌組織Evans blue含量（ng/mg）結(jié)果顯示，與非序貫組，hVEGF165組和Ang-1組相比，雙基因序貫組顯著減少，但高于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4．新生血管Lectin灌注檢測(cè)結(jié)果：
　　 功能血管數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與非序貫組、VEGF165組、Ang-1組、溶劑對(duì)照組和載體對(duì)照組相比，雙

10、基因序貫組明顯增加，但少于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 功能血管/新生毛細(xì)血管結(jié)果顯示，與hVEGF165組、Ang-1組、溶劑對(duì)照組及載體對(duì)照組相比，雙基因序貫組新生血管灌注功能明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 序貫組梗死邊緣區(qū)可見(jiàn)新生血管長(zhǎng)入。
　　 新生血管管徑結(jié)果顯示，與非序貫組、hVEGF165組、Ang-1組、溶劑對(duì)照組及載體對(duì)照組相比，序貫組管徑明顯增

11、粗，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 新生血管側(cè)支數(shù)結(jié)果顯示，與非序貫組、Ang-1組、溶劑對(duì)照組及載體對(duì)照組相比，序貫組側(cè)支顯著增多，但低于hVEGF165組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5．超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果：
　　 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果顯示，與其它各實(shí)驗(yàn)組相比，序貫組動(dòng)物心功能明顯改善，左心室收縮末期內(nèi)徑(LVSD)、舒張末期內(nèi)徑(LVDD)明顯減小。與非序貫組、hVEGF165組、An

12、g-1組、溶劑對(duì)照組和載體對(duì)照組相比，序貫組FS％值明顯提高，但低于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、在動(dòng)物整體水平，HIF-9HRE和Tet-on-advanced雙基因調(diào)控系統(tǒng)能有效調(diào)控hVEGF165和Ang-1基因的表達(dá)。
　　 2、序貫調(diào)控hVEGF165/Ang-1基因表達(dá)可有效促進(jìn)缺血心肌新生血管成熟及灌注功能的改善。
　　 3、序貫調(diào)控hVEGF