HIF-1α和COX對(duì)大鼠缺血組織血管生成和內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員的影響研究.pdf

1、1.背景與目的： 隨著人們生活水平的提高，冠心病的發(fā)病逐年增多，已成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病，冠心病的治療已從單純的藥物治療，發(fā)展到外科手術(shù)、冠脈介入等多種治療手段，但遠(yuǎn)期療效還不理想，對(duì)已壞死或凋亡心肌的治療目前尚無(wú)有效治療手段。最近細(xì)胞移植和冠脈血管再生治療成為了冠心病治療的新方法，對(duì)壞死、凋亡的心肌的修復(fù)取得了初步的療效，成為目前研究的熱點(diǎn)。 有研究發(fā)現(xiàn)急性心肌缺血可導(dǎo)致循環(huán)血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)增加，且這些細(xì)胞

2、可以向缺血心肌歸巢，在缺血局部促進(jìn)心肌和血管再生，減少心肌細(xì)胞因缺血導(dǎo)致的壞死和凋亡，從而改善心臟功能，減少死亡率；EPCs的移植還加速損傷血管內(nèi)皮修復(fù)、減少內(nèi)膜增生和預(yù)防血管狹窄。雖然EPCs移植治療冠心病的研究已開(kāi)始進(jìn)入臨床試驗(yàn)，且初步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種治療方法有效，但目前要獲得足夠的EPCs用于治療還比較困難，并且這種缺血導(dǎo)致的骨髓EPCs的動(dòng)員和向缺血心肌的歸巢機(jī)制尚不清楚，EPCs治療起效的確切機(jī)制還有爭(zhēng)議。弄清這種動(dòng)員、歸巢機(jī)制

3、對(duì)冠心病的細(xì)胞移植治療有重大意義。 缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)是一種缺氧誘導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白，它是由120KD的α亞基和91-94KD的β亞基組成的異二聚體，兩者都屬BHLH-PAS家族蛋白，HIF-1α是它的誘導(dǎo)型，HIF-1β是它的結(jié)構(gòu)型，在缺氧過(guò)程中主要是HIF-1α起作用。研究發(fā)現(xiàn)在人體許多組織缺血缺氧時(shí)，可誘導(dǎo)組織HIF-1α表達(dá)的增加，缺氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)的增加是機(jī)體對(duì)缺氧的一種適應(yīng)性反應(yīng)。HIF-1α又可對(duì)其靶

4、基因，如促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的生存、血管新生、能量代謝、激素代謝等多方面功能。已有研究發(fā)現(xiàn)VEGF、EPO、NOS對(duì)骨髓EPCs的動(dòng)員、歸巢有作用。因此我們推測(cè)缺血可能通過(guò)誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，然后作用于EPO，VEGF基因，從而誘導(dǎo)骨髓EPCs的動(dòng)員和向缺血區(qū)歸巢，HIF-1α在缺血誘導(dǎo)骨髓EPCs的動(dòng)員和歸巢中可能起重要作用。

5、 環(huán)氧化酶(COX)是催化花生四烯酸向血栓烷A2(TXA2)和前列腺素轉(zhuǎn)化的限速酶，有兩種酶形式即結(jié)構(gòu)型環(huán)氧化酶-1(COX-1)和誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶-2(COX-2)。COX-1存在于各種組織中，主要催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為T(mén)XA2，而COX-2催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素類(lèi)物質(zhì)，它可以被自由基、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生。TXA2是一血管收縮劑，可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和血小板聚集，而前列腺素類(lèi)物質(zhì)可抑制血小板的聚集，增加內(nèi)皮一氧化

6、氮合成酶(eNOs)的活性，誘導(dǎo)一氧化氮(NO)、VEGF的生成，有擴(kuò)張血管、抗氧化和抗血管平滑肌細(xì)胞增殖作用，也有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用。 在對(duì)腫瘤、消化性潰瘍及缺血性眼底血管生成疾病的研究中發(fā)現(xiàn)：COX-2的高誘導(dǎo)可促進(jìn)血管生成，而COX-2抑制可以抑制腫瘤及潰瘍的血管生成，研究還證實(shí)阿司匹林減少血液中的VEGF。因此，COX抑制劑包括阿司匹林因抑制COX-2已試用于抗腫瘤的血管生成治療。作為心血管疾病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防的基礎(chǔ)藥

7、物阿司匹林以其抑制COX-1而起抗血小板的聚集作用、預(yù)防冠脈血栓形成、降低了心血管不良事件的發(fā)生，但它的COX2抑制作用、減少血中VEGF的作用、抑制血管生成作用是否也會(huì)抑制缺血心肌的血管生成，對(duì)EPCs的動(dòng)員是否也有不良的作用呢?目前還不清楚。最近，COX-2抑制劑對(duì)心血管疾病患者的不良作用也得到證實(shí)，但其原因也不很清楚。 綜上所述，我們認(rèn)為1)HIF-1α在缺血誘導(dǎo)骨髓EPCs的動(dòng)員和歸巢中可能起重要作用。2)選擇性抑制CO

8、X-1用于抗血小板治療可能對(duì)冠心病更有利，3)COX-2可能通過(guò)對(duì)VEGF的作用而影響心肌血管生成和EPCs的骨髓動(dòng)員和活性。4)由于HIF-1α與COX-2都共同影響VEGF，因此HIF-1α與COX-2可能有相互作用。 本研究擬在大鼠下肢和心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷幕A(chǔ)上，通過(guò)反義寡核苷酸技術(shù)干預(yù)HIF-1α的基因表達(dá)和選擇性COX1和COX2抑制劑分別抑制COX1和COX2以探討HIF-1α和COX在缺血組織毛細(xì)血管生成和組織缺血

9、時(shí)EPCs動(dòng)員、歸巢中的作用及可能機(jī)制。 2.方法 本研究分四部分，第一部分用HIF-1α反義寡核苷酸抑制下肢缺血大鼠缺血組織的HIF-1α的表達(dá)，探討HIF-1α在大鼠缺血下肢血管生成及EPCs的動(dòng)員中的作用：建立下肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ停諬IF-1α反義寡核苷酸組和HIF-1α錯(cuò)義寡核苷酸組及對(duì)照組，分別給予相應(yīng)的干預(yù)，測(cè)定各組缺血組織HIF-1α的表達(dá)變化、毛細(xì)血管的密度、循環(huán)血EPCs和血漿VEGF。第二部分通過(guò)體外細(xì)

10、胞共培養(yǎng)遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞標(biāo)記在體示蹤實(shí)驗(yàn)，用HIF-1α反義寡核苷酸抑制缺血組織和細(xì)胞的HIF-1α的表達(dá)和氯化鈷致細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，觀察HIF-1α在心肌缺血時(shí)EPCs歸巢中的作用。第三部分建立急性心肌缺血模型，給予不同劑量的阿司匹林干預(yù)，測(cè)定循環(huán)血EPCs、血漿VEGF水平和缺血心肌毛細(xì)血管密度，以觀察不同劑量阿司匹林對(duì)缺血心肌毛細(xì)血管生成、心肌缺血時(shí)EPCs動(dòng)員和血漿VEGF的影響，從而了解環(huán)氧化酶在缺血EPCs動(dòng)員及

11、心肌血管生成中的作用。第四部分建立急性心肌缺血模型給予選擇性COX1和COX2抑制劑干預(yù)，測(cè)定各干預(yù)組的循環(huán)血EPCs、血漿VEGF、缺血心肌毛細(xì)血管密度，HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)一步觀察環(huán)氧化酶在EPCs動(dòng)員和缺血心肌血管生成中的作用機(jī)制及與HIF-1α的關(guān)系。 3.結(jié)果 1).HIF-1α反義寡核苷酸抑制大鼠缺血下肢血管生成及EPCs的動(dòng)員：HIF-1α反義寡核苷酸組的HIF-1αmRNA和VEGFmRNA及其蛋白表達(dá)

12、均較單純?nèi)毖M和錯(cuò)義寡核苷酸組明顯減少；HIF-1α反義寡核苷酸組的循環(huán)血EPCs、血漿VEGF及缺血區(qū)肌肉組織毛細(xì)血管密度均較單純?nèi)毖M和錯(cuò)義寡核苷酸組明顯減少，其余兩組間比較無(wú)顯著性差異。 2).HIF-1α在EPCs向缺血心肌歸巢中的作用：培養(yǎng)的心肌細(xì)胞與EPCs在Boyden小室共培養(yǎng)趨化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯化鈷化學(xué)缺氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)的心肌細(xì)胞明顯增加EPCs向其趨化，而在先加HIF-1α反義寡核苷酸處理后，這種氯化鈷化學(xué)

13、缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞HIF-1α表達(dá)明顯減少，EPCs向其趨化也明顯減少。在體實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)缺血局部反義寡核苷酸抑制了HIF-1α表達(dá)，acLDL-DiI標(biāo)記的EPCs體內(nèi)示蹤發(fā)現(xiàn)在該組中熒光面積明顯減少。 3).阿司匹林對(duì)大鼠缺血心肌血管生成及EPCs動(dòng)員的影響：?jiǎn)渭冃募∪毖M、假手術(shù)組與正常對(duì)照組相比，血漿VEGF和循環(huán)血EPCs顯著增多；心肌缺血加小劑量阿司匹林組與正常對(duì)照組相比，循環(huán)血EPCs顯著增多；單純心肌缺血組與正常對(duì)照組

14、相比，毛細(xì)血管密度顯著增加；大劑量阿司匹林抑制了因缺血導(dǎo)致的VEGF、EPCs和毛細(xì)血管密度的增加。 4).環(huán)氧化酶在大鼠缺血心肌血管生成及EPCs動(dòng)員中的作用及機(jī)制：心肌缺血加選擇性COX2抑制劑羅非昔布組與單純心肌缺血組、心肌缺血加選擇性COX1抑制劑VS組比較，血漿VEGF、循環(huán)血EPCs、缺血心肌毛細(xì)血管密度和HIF-1αmRNA表達(dá)均顯著減少(p＜0.05)；其余兩組比較無(wú)顯著性差異。 4.結(jié)論 1.H

15、IF-1α與組織缺血時(shí)的EPCs的動(dòng)員和EPCs向缺血區(qū)歸巢有關(guān)，其機(jī)制可能是其直接作用或通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF起作用，HIF-1α是缺血時(shí)EPCs的一個(gè)動(dòng)員因子。 2.HIF-1α反義寡核苷酸抑制缺血組織的血管生成，因此HIF-1α有促缺血組織的血管生成作用。 3.大劑量的環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林抑制心肌缺血時(shí)的EPCs的動(dòng)員和心肌血管生成，可能是大劑量時(shí)主要通過(guò)抑制環(huán)氧化酶2，從而抑制缺血心肌HIF-1α的表達(dá)及血漿VEGF