基底膜調(diào)控表皮細(xì)胞行為在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、目的：
　　表皮細(xì)胞生理行為對(duì)于皮膚創(chuàng)傷后再上皮化和組織結(jié)構(gòu)的重塑具有重要作用。然而，其作用的調(diào)控機(jī)制及其影響因素未完全闡明。因此，闡明表皮細(xì)胞增殖、分化和有絲分裂調(diào)控的影響因素及其相關(guān)分子機(jī)制，有利于引導(dǎo)皮膚創(chuàng)傷后創(chuàng)面組織的有序修復(fù)，或?yàn)樾纬山Y(jié)構(gòu)和功能兼?zhèn)涞钠つw組織替代物提供理論基礎(chǔ)，從而最終實(shí)現(xiàn)無(wú)延遲、無(wú)瘢痕的完美修復(fù)。
　　材料和方法：
　　1.收集臨床手術(shù)中的正常皮膚組織(Normal)7例、創(chuàng)面組織(Woun

2、d edge)8例和瘢痕組織(Scar)7例，通過(guò)HE、Masson和六胺銀染色比較其組織形態(tài)學(xué)差異。采用免疫熒光染色檢測(cè)基底膜成份Ⅳ型膠原(CollagenⅣ)、層粘連蛋白(Laminin)和Laminin-5及其受體整合素(Integrin-β4)的表達(dá)分布差異，同時(shí)檢測(cè)CK10、CK14、CK5、CK19和Integrin-β1的表達(dá)以明確三種組織內(nèi)表皮細(xì)胞分化譜系的差異。
　　2.使用Ca2+刺激原代人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(H

3、uman epidermal keratinocyte，HEK)和人永生化表皮細(xì)胞(Human immortalized keratinocyte，HaCaT)構(gòu)建表皮細(xì)胞分化的體外模型。體外采用MaxGelTM ECM模擬表皮基底膜，通過(guò)免疫熒光和Westernblot檢測(cè)Integrin-β4表達(dá)情況，并通過(guò)Real-time qPCR和Western blot檢測(cè)CK10、CK14和CK19的表達(dá)水平，明確其對(duì)HEK和HaCaT細(xì)

4、胞增殖和分化行為的影響。
　　3.采用激光共聚焦斷層掃描結(jié)合三維組織結(jié)構(gòu)重建技術(shù)，比較Normal、Woundeedge和Scar組織中細(xì)胞極性蛋白分子PAR3的表達(dá)分布情況，并通過(guò)Pericentrin和Survivin分別標(biāo)記中心粒(Centrosome)和中心顆粒體(Spindle midbody)，從兩種途徑來(lái)分析三種組織內(nèi)表皮細(xì)胞的有絲分裂方向差異。
　　4.采用免疫熒光染色檢測(cè)PAR3和Integrin-β4在N

5、ormal、Wounde edge和Scar組織表達(dá)分布關(guān)系，同時(shí)檢測(cè)三種組織內(nèi)真皮成纖維細(xì)胞(Human dermalfibroblast，HDF)標(biāo)記分子α-SMA的表達(dá)分布情況。體外使用MaxGelTM ECM模擬表皮基底膜，同時(shí)聯(lián)合HDF細(xì)胞培養(yǎng)上清液，借助激光共聚焦斷層掃描結(jié)合三維組織結(jié)構(gòu)重建技術(shù)分析二者對(duì)HEK和HaCaT細(xì)胞內(nèi)PAR3和Integrin-β4空間表達(dá)分布的影響，并通過(guò)Real-time qPCR和Weste

6、rn blot檢測(cè)二者對(duì)HEK和HaCaT細(xì)胞內(nèi)PAR3、Integrin-β4表達(dá)水平的影響，從而探索表皮細(xì)胞有絲分裂方向調(diào)控的分子機(jī)制。此外，采用Micro-contact printing結(jié)合Time-lapse相差顯微鏡實(shí)時(shí)觀察分析細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和HDF細(xì)胞對(duì)HEK細(xì)胞有絲分裂方向的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1.創(chuàng)傷修復(fù)中的Normal、Wound edge和Scar

7、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及表皮細(xì)胞分化譜系均存在明顯差異。相對(duì)于Normal組織，Wound edge組織表皮細(xì)胞呈明顯增殖狀態(tài)，而Scar組織基底膜結(jié)構(gòu)異常，且表皮細(xì)胞呈高分化狀態(tài)。這提示，基底膜可能影響表皮細(xì)胞的分化譜系，進(jìn)而干預(yù)創(chuàng)傷修復(fù)的結(jié)局。
　　2.體外使用MaxGelTM ECM模擬表皮基底膜可以增強(qiáng)HEK和HaCaT細(xì)胞內(nèi)Integrin-β4的表達(dá)水平，抑制Ca2+刺激引起的HEK和HaCaT細(xì)胞分化。這表明，基底膜能夠通過(guò)與

8、表皮細(xì)胞的黏附活動(dòng)，調(diào)控其增殖和分化行為。
　　3.表皮細(xì)胞極性蛋白分子PAR3在Normal、Wound edge和Scar組織表達(dá)分布不同，且表皮細(xì)胞的有絲分裂方向存在明顯差異，表現(xiàn)為其在Normal和Woundedge組織呈有序分裂，而在Scar組織成無(wú)序的紊亂分裂。這提示，創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，表皮細(xì)胞有絲分裂方向與修復(fù)結(jié)局密切相關(guān)，其可能受基底膜黏附作用的影響。
　　4.PAR3和Integrin-β4在Normal、W

9、ounde edge和Scar組織均呈共定位表達(dá)分布。其中，Scar組織基底膜處PAR3和Integrin-β4表達(dá)分布異常，同時(shí)其基底膜側(cè)α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的HDF細(xì)胞數(shù)量減少，提示創(chuàng)傷修復(fù)早期區(qū)域性的HDF細(xì)胞缺失可能與基底膜修復(fù)異常有關(guān)。體外使用MaxGelTM ECM模擬表皮基底膜，同時(shí)聯(lián)合HDF細(xì)胞培養(yǎng)上清液，均可以影響PAR3和Integrin-β4在HEK和HaCaT細(xì)胞空間表達(dá)分布和表達(dá)水平，其作用機(jī)制可能有涉及到ERK

10、通路。此外，體外HDF細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以影響ECM與HEK細(xì)胞黏附作用，調(diào)控HEK有絲分裂的方向。這表明，基底膜可以通過(guò)與表皮細(xì)胞的黏附活動(dòng)，調(diào)控其有絲分裂的方向，這在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)具有重要作用。
　　結(jié)論:
　　皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，基底膜可以通過(guò)其與表皮細(xì)胞的黏附作用，影響表皮細(xì)胞生活的外界微環(huán)境，調(diào)控表皮細(xì)胞的增殖、分化及有絲分裂方向等細(xì)胞行為，從而干預(yù)創(chuàng)傷后再上皮化和上皮組織結(jié)構(gòu)重塑。而創(chuàng)傷修復(fù)早期，HDF細(xì)胞的缺失可能