皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中P物質(zhì)對(duì)表皮干細(xì)胞募集、分化的調(diào)控作用.pdf

1、皮膚創(chuàng)傷愈合是一個(gè)異常復(fù)雜的過(guò)程，有多種修復(fù)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子參與。這些細(xì)胞和細(xì)胞因子之間有著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。它涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、粘附、通訊、增殖和分化等細(xì)胞生物學(xué)的多個(gè)方面。然而創(chuàng)傷愈合又是一個(gè)十分有序的過(guò)程，在機(jī)體精確的調(diào)控下，修復(fù)過(guò)程有條不紊的進(jìn)行。近年研究表明，多種干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷的修復(fù)起到關(guān)鍵的作用，特別是表皮干細(xì)胞被認(rèn)為是皮膚及其附屬器修復(fù)的源泉細(xì)胞。因此，闡明其分化、遷移的調(diào)控機(jī)制是實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面完美愈合的關(guān)鍵，也是表皮干細(xì)胞走向

2、臨床的關(guān)鍵。 過(guò)去研究發(fā)現(xiàn)，感覺(jué)神經(jīng)末梢分泌的感覺(jué)神經(jīng)肽類物質(zhì)(如P物質(zhì)、CGRP等)可以促進(jìn)傷口愈合，其機(jī)制可能和啟動(dòng)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)、調(diào)控免疫細(xì)胞功能、促使修復(fù)細(xì)胞增殖等有關(guān)。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常皮膚傷口愈合過(guò)程中，外源性神經(jīng)肽P物質(zhì)(substanceP，SP)可以促進(jìn)大量表皮干細(xì)胞募集于的創(chuàng)緣及肉芽組織中，加速傷口愈合。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步驗(yàn)證P物質(zhì)促進(jìn)表皮干細(xì)胞向肉芽組織中募集這一重要發(fā)現(xiàn)，本研究首先利用β1整合素、K

3、19、K15等干細(xì)胞標(biāo)記物以及干細(xì)胞慢周期性的特點(diǎn)(Brdu標(biāo)記)，分別在體觀察了正常皮膚傷口愈合過(guò)程中SP組(傷口給予外源性SP)、辣椒素組(采用特異性感覺(jué)神經(jīng)毒性藥物辣椒素(capsaicin)皮下預(yù)注射化學(xué)性除去感覺(jué)神經(jīng)從而阻止神經(jīng)肽分泌)、對(duì)照組肉芽組織中表皮干細(xì)胞分布特點(diǎn)；其次，糖尿病患者皮膚存在周?chē)┥疑窠?jīng)的損傷和神經(jīng)肽含量的下降，這是否會(huì)導(dǎo)致糖尿病皮膚傷口創(chuàng)緣表皮干細(xì)胞募集不足，繼發(fā)傷口難愈?為驗(yàn)證此猜想，我們?cè)谔悄虿〈笫?/p>

4、——這一“先天性皮膚感覺(jué)神經(jīng)肽匱乏”模型上先觀察了糖尿病大鼠患病不同時(shí)期皮膚基底層表皮干細(xì)胞變化趨勢(shì)；繼而在糖尿病大鼠難愈傷口模型上觀察了外源性SP對(duì)表皮干細(xì)胞募集、遷移的誘導(dǎo)作用。 為深入研究P物質(zhì)和表皮干細(xì)胞分化的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)首先在體外成功培養(yǎng)表皮干細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，分別從蛋白和mRNA兩個(gè)水平檢測(cè)離體培養(yǎng)表皮干細(xì)胞上是否存在SP特異性受體(NK-1R,NK-2R)及其mRNA表達(dá)；之后

5、在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入SP和不同受體阻斷劑，利用α6整合素和CD71兩種標(biāo)記物作為ESCs、TAC、PM-D的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定分群和細(xì)胞比例分析，觀察SP對(duì)培養(yǎng)表皮干細(xì)胞分化的影響。 結(jié)果顯示：正常皮膚傷口愈合過(guò)程中只在SP組各時(shí)相點(diǎn)肉芽組織中發(fā)現(xiàn)了Brdu、K19、K15及β1整合素標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，而辣椒素組和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)。在糖尿病鼠模型上，患病大鼠表皮厚度隨著患病時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變薄，和對(duì)照組相比在患病后3周

6、開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異，5周左右至最低點(diǎn)。具有相同的趨勢(shì)，基底層標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞率在患病后2周也開(kāi)始減少，至患病后6～7周降至最低點(diǎn)。在糖尿病鼠難愈傷口模型上，外源性SP能顯著加速傷口愈合。同時(shí)，隨著傷口的逐漸愈合，創(chuàng)緣及新生上皮中標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均有所增加，但SP組較對(duì)照組增加更為顯著。激光共聚焦顯微鏡觀察及RT-PCR結(jié)果顯示，在離體培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞中檢測(cè)到了NK-1R和NK-2R抗原存在及mRNA的表達(dá)。在加入刺激劑培養(yǎng)96小時(shí)后，通過(guò)流式

7、細(xì)胞儀檢測(cè)到SP組(培養(yǎng)基中加入SP)中89.7％的細(xì)胞分化為T(mén)AC細(xì)胞(特征為整合素α6和CD71均為高表達(dá))；NK-1R阻斷組(培養(yǎng)基中加入SP和NK-1R阻斷劑)有70.7％的細(xì)胞分化為T(mén)AC細(xì)胞。NK-2R阻斷組(培養(yǎng)基中加入SP和NK-2R阻斷劑)中可見(jiàn)60.1％的細(xì)胞仍然為表皮干細(xì)胞(特征為整合素α6高表達(dá)而CD71低表達(dá))，30.7％的細(xì)胞分化為T(mén)AC，只有9.2％的細(xì)胞分化為PM-D細(xì)胞(特征為整合素α6低表達(dá))。

8、 研究結(jié)果提示：①正常皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，SP可以促進(jìn)表皮干細(xì)胞向創(chuàng)緣、肉芽組織中募集，從而加速傷口愈合；②糖尿病大鼠皮膚隨著患病時(shí)間延長(zhǎng)逐漸變薄，基底層表皮干細(xì)胞數(shù)逐漸減少。即糖尿病鼠皮膚中表皮干細(xì)胞庫(kù)“干涸”可能是糖尿病皮膚菲薄、傷口難愈的機(jī)理之一；③糖尿病鼠皮膚傷口愈合過(guò)程中，SP可以明顯促進(jìn)表皮干細(xì)胞向創(chuàng)緣、肉芽組織中募集從而加速糖尿病傷口愈合；④表皮干細(xì)胞存在P物質(zhì)特異性受體NK-1R/NK-2R(表達(dá)NK-1RmRNA和N