不同基底硬度在調(diào)控HepaRG細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞中的作用.pdf

1、背景及目的:急性肝衰竭(ALF)是因肝細(xì)胞大量壞死至肝功能?chē)?yán)重不足而引起的一系列臨床癥狀的綜合征，病死率高。肝移植仍是目前治療急性肝衰竭最主要的手段，然而因供體器官短缺、免疫排斥、費(fèi)用昂貴等原因，肝移植仍不能被廣泛運(yùn)用到臨床上。這使得發(fā)展生物人工肝(BAL)，延長(zhǎng)急性肝衰竭患者的生存期，提高他們的生存狀態(tài)，引起人們高度重視。而如何獲取大量可利用肝細(xì)胞一直以來(lái)被認(rèn)為是發(fā)展生物人工肝的難題。HepaRG細(xì)胞是在2002年首次分離出來(lái)的肝祖細(xì)

2、胞系，HepaRG細(xì)胞在二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)下可分化為有功能的肝細(xì)胞樣和膽管細(xì)胞樣細(xì)胞，分化后的細(xì)胞適用于BAL、人肝細(xì)胞模型、研究病毒性肝炎機(jī)制等，但DMSO也會(huì)抑制分化后的細(xì)胞表達(dá)ALB、細(xì)胞色素P450、氨的消除、細(xì)胞增生等特殊肝功能，這促使我們?nèi)ふ腋行У恼T導(dǎo)HepaRG細(xì)胞分化的方法。而近年來(lái)有國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可以調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為比如細(xì)胞遷移、增生、分化等。本研究立足以此，通過(guò)構(gòu)建基底彈性梯度ECM系

3、統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞分化，初步探索基底硬度調(diào)控HepaRG細(xì)胞快速分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的可行性，為BAL提供新的肝細(xì)胞來(lái)源。
　　方法:
　　1、構(gòu)建4組不同硬度的基底（4s組、8s組、16s組、Glass組）和ALB-GFP熒光報(bào)告細(xì)胞系系統(tǒng)，HepaRG細(xì)胞分別接種于4種基底上，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞ALB表達(dá)和運(yùn)用倒置顯微鏡觀察HepaRG細(xì)胞分化前后的形態(tài)變化，來(lái)鑒定各組HepaRG細(xì)胞分化效果;
　　2、阿爾瑪藍(lán)(A

4、lamarbule)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況;
　　3、免疫熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞力學(xué)響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(YAP)的表達(dá)，初步探查軟的基底誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞分化原因。
　　結(jié)果:
　　1、ALB-GFP熒光報(bào)告細(xì)胞系系統(tǒng)及運(yùn)用Image J軟件對(duì)ALB表達(dá)分析結(jié)果顯示:在第4h，4s組分別與8s組、16s組、Glass組HepaRG細(xì)胞中ALB的表達(dá)量比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;在第4d，4組HepaRG細(xì)胞中ALB的表達(dá)量互相

5、比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，4s組ALB的表達(dá)量高于16s組和Glass組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，4s組與8s組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;在第7d，4組HepaRG細(xì)胞中ALB的表達(dá)量互相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，4s組分別和8s組、16s組、Glass組比較，其ALB的表達(dá)量較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
　　2、倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示:在誘導(dǎo)分化第0天(4h)，HepaRG細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)一致的瘦長(zhǎng)形細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Hep

6、aRG細(xì)胞從第4天達(dá)到匯合后開(kāi)始出現(xiàn)分化;在第7天，HepaRG細(xì)胞基本分化為兩種形狀不同的細(xì)胞，一種呈現(xiàn)肝細(xì)胞樣顆粒狀上皮細(xì)胞，有1至2個(gè)細(xì)胞核，另一種圍繞著第一種細(xì)胞，呈現(xiàn)扁平狀，有清晰的細(xì)胞質(zhì)，肝細(xì)胞樣細(xì)胞約占總細(xì)胞數(shù)50-55％。
　　3、Alamar bule檢測(cè)結(jié)果顯示:在第4d，4s組的細(xì)胞總數(shù)分別和8s組、16s組、Glass組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;在第7d，4s組的細(xì)胞總數(shù)分別和8s組、16s組、Glass

7、組比較，差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
　　4、免疫熒光染色檢測(cè)YAP結(jié)果顯示:最軟基底上的YAP主要定位在細(xì)胞質(zhì)里，中間硬度基底上的YAP在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核里都有定位，最硬基底上的YAP主要定位在細(xì)胞核里。
　　結(jié)論:
　　1、軟的基底更有利于肝祖細(xì)胞系HepaRG細(xì)胞快速向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化。
　　2、軟的基底在誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞分化時(shí)不影響細(xì)胞增殖活性，HepaRG細(xì)胞有望為生物人工肝提供所需的肝細(xì)胞。
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