灰額刺尾魚(Acanthurus glaucopareiu)潰瘍病病原分離及其胞外產(chǎn)物的研究.pdf

1、近年來，海水觀賞魚越來越受到人們的青睞，灰額刺尾魚(Acanthurusglaucopareius)作為一種常見的海水觀賞魚，以其艷麗的色彩、優(yōu)美的體形而倍受人們的喜愛，然而由于養(yǎng)殖過程中的疏忽及防病意識的淡泊，導(dǎo)致大量魚病的出現(xiàn)?；翌~刺尾魚潰瘍病作為一種典型的疾病，本試驗(yàn)從臨床病癥上診斷灰額刺尾魚潰瘍病，并對該病的病原學(xué)進(jìn)行研究，檢測胞外產(chǎn)物是否為該病的毒力因子，為以后的養(yǎng)殖生產(chǎn)提供更多的理論依據(jù)。
　　 海南某觀賞魚場中，灰

2、額刺尾魚出現(xiàn)行動遲緩，食欲減退，體表潰爛，魚鰭伴有充血現(xiàn)象，眼球突出，晶體混濁，角膜潰爛，腸道內(nèi)無內(nèi)容物，肝臟腫脹，腎臟腫大，肛門紅腫等病癥。從灰額刺尾魚體表潰爛處及鰓部采樣顯微鏡鏡檢，未發(fā)現(xiàn)有寄生蟲寄生，尾靜脈采血用Giemsa染色法制作血涂片，觀察到有白細(xì)胞數(shù)量增多。再從體表潰爛處及內(nèi)部器官中分離到五株有較強(qiáng)致病力的菌株，人工回歸感染試驗(yàn)選用注射和浸泡兩種方式，感染濃度都為3×108CFU/mL，結(jié)果表明浸染組的感染率為75％，而注

3、射組為100％。從人工感染發(fā)病的灰額刺尾魚病灶部位再次分離的優(yōu)勢菌與其菌株C100311的生理生化性質(zhì)一致，回歸感染灰額刺尾魚后仍能出現(xiàn)與自然發(fā)病情況下相同的癥狀，結(jié)果表明菌株C100311為致病菌。對該病原菌進(jìn)行了形態(tài)、生理生化反應(yīng)測試，其主要特征為革蘭氏陰性，具動力的短桿菌，無芽孢。生理生化試驗(yàn)及Biolog全自動微生物鑒定系統(tǒng)結(jié)果顯示為溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。應(yīng)用細(xì)菌16SrDNA的通用引物對該菌基因組

4、DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆測序，得到1條長度為1392bp的核苷酸序列，該序列與溶藻弧菌(登錄號GQ455008)的16srDNA基因序列同源性達(dá)99％，進(jìn)一步確定該致病菌為溶藻弧菌。采用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株對痢特靈、氟哌酸、環(huán)丙沙星等藥物敏感，該菌株對甲氧胺嘧啶、氨芐青霉素、阿米卡星、青霉素等藥物耐藥。
　　 采用玻璃紙平板覆蓋法提取菌株C100311的胞外產(chǎn)物(ECP)，用PBS洗下培養(yǎng)物，離心后上清液用0.

5、22μm的微孔濾膜過濾制備了胞外產(chǎn)物粗提液。用雙層紙片法鑒定該胞外產(chǎn)物具有蛋白酶、淀粉酶及溶血性。首先確定硫酸銨的最適飽和度為70％，利用硫酸銨鹽析、SephadexG-25凝膠層析及Microcon超濾離心管濃縮等蛋白純化步驟后，ECP粗提液經(jīng)過SephadexG-25凝膠過濾層析，洗脫曲線有一個蛋白吸收峰，收集該峰的洗脫液。采用考馬斯藍(lán)法測定蛋白含量，以偶氮酪蛋白底物測定酶活力，測定純化倍數(shù)為3.62，產(chǎn)率為19.0％。再經(jīng)聚丙烯酰

6、胺凝膠電泳(SDS-PAGE)得到一分子量為33kD的胞外蛋白酶(ECPase)，將濃縮蛋白以2倍倍比稀釋法對灰額刺尾魚進(jìn)行致病性研究，結(jié)果表明該致病該蛋白酶對灰額刺尾魚有一定的致病性，蛋白濃度為0.836mg/mL時，肌肉注射灰額刺尾魚8小時后，開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡，注射處出現(xiàn)明顯的潰瘍病灶，局部肌肉溶解壞死，死亡率達(dá)87.5％。蛋白濃度為0.104mg/mL時，肌肉注射灰額刺尾魚后，逐步出現(xiàn)食欲下降、行動遲緩、反應(yīng)遲鈍等癥狀，死亡率僅為

7、12.5％，對灰額刺尾魚的半數(shù)致死濃度達(dá)到0.63μg/g體重，證明溶藻弧菌的胞外蛋白酶是一種毒力因子。菌株C100311的胞外蛋白酶能被苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制酶活性，說明該蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶。該酶最適反應(yīng)溫度為50℃，對熱不穩(wěn)定，最適pH為9，最適溫度范圍為30-50℃，最適pH范圍為8-10，符合灰額刺尾魚的生長環(huán)境。不被SDS、EDTA、Urea抑制酶活力，Mg2+、Ca2+能輕微提高酶活力，Zn2+、Cu2+、F