TcLr35小麥抗病相關(guān)基因的克隆及分析.pdf

1、植物抗病基因克隆研究對(duì)于抗病育種和抗病機(jī)制的理解具有重要意義。而小麥不僅基因組龐大(1.6×1016bp)，相當(dāng)于水稻基因組的近40倍，且重復(fù)序列含量豐富，這些特點(diǎn)使尋找小麥抗病基因區(qū)段兩側(cè)的分子標(biāo)記比較困難，增加了染色體步移或重疊克隆群構(gòu)建的難度。抗病基因同源片段的克隆，定位及其與已知抗病基因的連鎖分析，為克隆小麥抗病基因提供了新的思路。本論文根據(jù)已克隆的植物抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，采用同源克隆技術(shù)，并結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增(r

2、apidamplificationcDNAend，RACE)和熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR，TAIL-PCR)技術(shù)對(duì)小麥抗病基因同源序列進(jìn)行了研究。同時(shí)，利用RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)和RACE技術(shù)篩選TcLr35小麥病程相關(guān)蛋白基因cDNA全長(zhǎng)。主要研究結(jié)果如下： (1)根據(jù)抗病基因核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotidebindingsite

3、，NBS)、富含亮氨酸重復(fù)(Leucine-richrepeats，LRR)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，從攜帶小麥抗葉銹病基因Lr35的回交6代近等基因系TcLr35中獲得了4個(gè)通讀的小麥抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2、S2A2和LRR1。其中3個(gè)片段含有NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域，與已知抗病基因I2C-1，L6，RPS2等相應(yīng)區(qū)域相一致，具有抗病基因NBS特征結(jié)構(gòu)域(P環(huán)、激酶2a、激酶3a等)。LRR1含有3個(gè)完整的LRR重復(fù)單元，

4、與水稻抗白葉枯病基因Xa21基因具有較高同源性。 (2)以S2A2為靶序列，利用RACE技術(shù)獲得了cDNA全長(zhǎng)2693bp的TcLr35小麥抗病相關(guān)基因，該基因包含1887bp的開放閱讀框，230bp的5’非翻譯區(qū)(untranslatedregion，UTR)，533bp的3’非翻譯區(qū)和21bp的多聚腺苷酸尾。在233bp處有ATG起始密碼子，2117bp處有TAG終止密碼子，編碼628個(gè)通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列，基因編碼產(chǎn)物具

5、有NBS、LRR等抗病基因保守結(jié)構(gòu)域。初步認(rèn)為S2A2基因?yàn)镃C-NBS-LRR類抗病相關(guān)基因。在GenBank獲得的登錄號(hào)為DQ205351。利用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因的表達(dá)情況研究表明，S2A2基因?yàn)榈拓S度組成型表達(dá)，其表達(dá)不受病原菌接種的誘導(dǎo)。 (3)利用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR技術(shù)獲得了2個(gè)Lr35相關(guān)基因組DNA片斷RGA1的側(cè)翼序列，長(zhǎng)度分別為511bp和614bp，與RGA1重疊區(qū)分別為293bp和509bp，分

6、別向3’端和5’端延長(zhǎng)了208bp和100bp，拼接后序列為915bp。經(jīng)BLASTn同源性比較，與小麥抗葉銹病基因Lr21同源性為93﹪(score值為674，E值為0.0)，與含有Lr10基因的450kb大片斷重疊群同源性為90﹪(score值為260，E值為7e-66)。 (4)根據(jù)已發(fā)表的植物病程相關(guān)蛋白1基因和β(1，3；1，4)葡聚糖苷酶基因設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從被小麥葉銹菌誘導(dǎo)的小麥抗葉銹病近

7、等基因系材料TcLr35中獲得2個(gè)病程相關(guān)蛋白基因cDNA全長(zhǎng)。其中，756bp的小麥病程相關(guān)蛋白1基因PR12包含495bp的開放讀碼框，147bp的5’非翻譯區(qū)(untranslatedregion，UTR)，155bp的3’非翻譯區(qū)和21bp的多聚腺苷酸尾。編碼164個(gè)通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列，基因產(chǎn)物具有植物防御體系中病程相關(guān)蛋白SCP保守結(jié)構(gòu)域，與GenBank中多個(gè)植物病程相關(guān)蛋白1基因具有較高的同源性。Southern雜交顯

8、示，該基因在TcLr35小麥基因組中為單拷貝。PR34cDNA全長(zhǎng)序列為1340bp，具有一個(gè)編碼303個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF)，其起始密碼子ATG位于77bp處，終止密碼子TAG位于988bp處，3’末端有29bp的poly(A)尾，323bp的3’非翻譯區(qū)。與GenBank中小麥、大麥等多個(gè)葡聚糖苷酶基因具有較高同源性；對(duì)其推斷的氨基酸序列進(jìn)行分析，含有Glyco_hydro_17保守結(jié)構(gòu)域，為葡聚糖苷酶基因蛋白結(jié)構(gòu)域。Sou