葉銹菌誘導(dǎo)的TcLr24 cDNA文庫構(gòu)建及GMP合成酶基因的克隆與分析.pdf

1、小麥葉銹病是由小麥葉銹菌（Puccinia triticina）引起的一種世界性小麥重要病害，抗病品種的選育和合理利用是防治該病最經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保安全的方法?？共』虻目寺〖跋嚓P(guān)功能研究為基因的合理利用提供重要依據(jù)。
　　小麥抗葉銹病基因Lr24來源于長穗偃麥草(Agropyron elongatum)，國內(nèi)外目前未見有對(duì)該基因有毒力菌株的報(bào)道。本研究以小麥抗葉銹近等基因系TcLr24幼苗為材料，構(gòu)建受小麥葉銹菌脅迫的cDNA文庫

2、，并對(duì)文庫進(jìn)行了初步篩選;繼而以一個(gè)TcLr24中特異表達(dá)的RNF片段為靶序列，通過cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)獲得其cDNA序列全長，并構(gòu)建的原核表達(dá)載體對(duì)該基因進(jìn)行原核表達(dá)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、以TcLr24為材料，分別于接菌后0h、6h、12h、18h、24 h、36h、48 h、60 h、72 h、96 h剪取葉片，提取各時(shí)間點(diǎn)的總RNA，等量混合后純化mRNA作為反轉(zhuǎn)錄模板。用In-Fusion SMAR

3、TerTM Directional cDNA Library Construction Kit構(gòu)建了不同時(shí)間點(diǎn)混合的TcLr24葉片的cDNA文庫。文庫包含2.1×106個(gè)單克隆，插入片段介于在0.5-1.5 kb之間，平均插入片段大小為1.0 kb。隨機(jī)挑取30個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)與ATP結(jié)合蛋白、細(xì)胞周期T1家族蛋白、纖維鞘CABYR結(jié)合蛋白、生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和組蛋白去乙?；窰DAC3等相關(guān)的EST序列。
　　2、以前期

4、研究利用RNA指紋圖譜技術(shù)獲得的在TcLr24和Thatcher與小麥葉銹菌互作時(shí)的差異表達(dá)片段R27和3'RACE序列為靶序列，提取TcLr24的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)5'RACE擴(kuò)增引物，應(yīng)用Touchdown程序從cDNA模板中擴(kuò)增得到750bp的目的片段，經(jīng)回收測(cè)序，成功與靶序列拼接，得到cDNA1475 bp全長基因序列。根據(jù)開放閱讀框兩側(cè)設(shè)計(jì)全長基因引物，分別在TcLr24 gDNA和cDNA中獲得1048bp和1

5、816bp的條帶并測(cè)序?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該基因含4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子。該基因包含1038 bp的開放閱讀框，編碼345個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸序列，221 bp的5'非翻譯區(qū)，216 bp的3'非翻譯區(qū)和29 bp的多聚腺苷酸尾，該基因編碼產(chǎn)物具有GMP合成酶、天冬酰胺合酶等結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析表明:該基因與山羊草和大麥親緣關(guān)系較近，與高粱親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該蛋白的分子量是38.64 kDa，是親水性蛋白。小麥染色體缺體四體定位將該基因定位于1B染