綠色熒光蛋白基因在胡蘿卜細胞中的高效表達及其轉化體的篩選研究.pdf

1、植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物具有生長迅速、周期短、易于工業(yè)化控制、不受環(huán)境影響等優(yōu)點，目前已廣泛應用于醫(yī)藥、食品等領域中。但是由于植物細胞培養(yǎng)自身特點所致，迄今為止實現(xiàn)工業(yè)化培養(yǎng)的植物細胞種類不多，其中光照是一個非常重要的影響因素，光照時間的長短、光質和光的強度對細胞生長及次級代謝產(chǎn)物的積累都有一定的影響。目前植物細胞培養(yǎng)的光照，往往考慮在普通生物反應器上增加光照系統(tǒng)，但許多資料研究表明，在生物反應器上安裝光源并不能很好的解決植物細

2、胞所需的光照問題。為了找到解決植物細胞培養(yǎng)光照問題的方法，本課題探索著從內(nèi)生光的角度出發(fā)，即通過植物轉基因技術獲取具有發(fā)光能力的細胞，利用發(fā)光細胞所產(chǎn)生的光作為光源提供給植物細胞培養(yǎng)。 發(fā)光生物在自然界中廣泛存在，如螢火蟲、發(fā)光細菌、水母等，這些發(fā)光生物體內(nèi)的熒光素均己被確知，且有部分熒光素基因如水母體內(nèi)的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因已被克隆并導入到其它生物體內(nèi)，重組生物體具

3、有與水母類似的發(fā)光性質。本課題試圖通過植物轉基因技術獲取發(fā)光植物細胞：通過根癌農(nóng)桿菌介導基因轉化的方法，將已構建好的重組質粒PBIl21-EGFP中的EGFP基因導入胡蘿卜細胞中，并抗性篩選出具有高效穩(wěn)定表達的發(fā)出熒光的細胞，為進一步探索通過發(fā)光植物細胞為細胞培養(yǎng)提供或補充光照提供基礎性研究。主要研究結果如下： 1．EHA105介導基因轉化胡蘿卜細胞 利用凍融法成功地將重組質粒PBIl21-EGFP導入農(nóng)桿菌EHA10

4、5，并確定了最佳轉化效果時重組質粒的濃度。 重組農(nóng)桿菌：EHA105介導：EGFP基因轉化胡蘿卜細胞，轉化體系為：胡蘿卜愈傷組織預培養(yǎng)時間為10d，農(nóng)桿菌EHA105的浸染濃度為OD<,600>:0.4，浸染時間25min，共培養(yǎng)條件：25℃、黑暗、培養(yǎng)時間3d，脫菌時抗生素頭孢噻肟鈉濃度為250mg/L，篩選時卡那霉素濃度為50mg/L。結論：熒光顯微鏡下觀測到綠色熒光細胞團，并用PCR法檢測出目的基因條帶，證實目的基因

5、EGFP已成功導入胡蘿卜細胞并獲得表達，轉化效率約為10％，轉化細胞團發(fā)出的熒光強度較弱。 2．EHA105介導轉化的方法改進 乙酰丁香酮(AS)不同使用方式下的轉化效率，實驗結果表明：在固態(tài)共培養(yǎng)基中加入AS時其轉化率最高，達90％(以細胞團數(shù)計算)，且轉化體的熒光強度最強；在植物細胞表面上加AS時轉化效率約為80％(以細胞團數(shù)計算)，轉化體發(fā)光強度比固態(tài)培養(yǎng)基中加入AS時略弱；在液態(tài)培養(yǎng)基中加入AS已在第二章實驗

6、過，其轉化效率約為10％(以細胞團數(shù)計算)，且熒光強度較弱。 結論：在固態(tài)培養(yǎng)基中加入As的方法可明顯提高轉化效率。 采用液態(tài)共培養(yǎng)基進行轉化實驗：通過配制適宜農(nóng)桿菌與植物細胞共同生長的液態(tài)培養(yǎng)基，并利用該液態(tài)培養(yǎng)基進行基因轉化實驗，轉化結果顯示：所得到的轉化體的熒光強度比在固態(tài)共培養(yǎng)基中加入AS還要強，其轉化效率約為10％。 3．溫度與抗生素結合脫菌實驗 將共培養(yǎng)后的轉化體置于37℃條件下培養(yǎng)3d，取出移至含有

7、頭孢噻肟鈉(250mg/L)的新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。結果：脫菌效果明顯，EHA105在l8d內(nèi)能得到有效的抑制，比單獨采用抗生素脫菌的抑制效果(抑制時間一般為6-7d)明顯增強。 4．單細胞轉化及其篩選實驗 在含有胡蘿卜單細胞的MS液態(tài)培養(yǎng)基中加入EHA105菌液，然后將此MS培養(yǎng)液與等體積的MS固態(tài)培養(yǎng)基混合，再鋪在培養(yǎng)皿上，厚度約2mm，培養(yǎng)皿置于25℃、黑暗條件下培養(yǎng)3d。結果顯示：大量小細胞團或單細胞發(fā)出綠光，在