綠色熒光蛋白(gfp)基因的克隆、表達和粗提取

1、1綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆、表達和粗提取基因的克隆、表達和粗提取南方醫(yī)科大學(xué)2011預(yù)防醫(yī)學(xué)（衛(wèi)生檢驗檢疫）摘要目的目的：研究綠色熒光蛋白（greenfluescentprotein，GFP）基因在大腸桿菌中的基因克隆與重組表達，以及對其進行粗提取。方法方法：從E.coliDH5ɑ中用堿提取質(zhì)粒的方法提取質(zhì)粒pEGFPN3和質(zhì)粒pET28a。然后用質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳對已經(jīng)提取的產(chǎn)物進行電泳，確定從大腸桿菌中成

2、功提取了質(zhì)粒。再用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI對成功提取的質(zhì)粒進行酶切，并對酶切后的質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳，用以確定已經(jīng)提取了GFP基因。將含有GFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coliBL21中，用LB培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化后的E.coli進行擴大培養(yǎng)。用IPTG誘導(dǎo)GFP基因表達可以看到淺綠色菌落。最后對綠色熒光蛋白進行粗提取。結(jié)論結(jié)論：本實驗有助于學(xué)生掌握最基本的分子生物學(xué)實驗技術(shù)，為進一步的實驗奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白基

3、因克隆重組表達轉(zhuǎn)化粗提取31前言前言綠色熒光蛋白（greenfluescentprotein，GFP）是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當(dāng)受到紫外或藍光激發(fā)時，GFP發(fā)射綠色熒光。它產(chǎn)生熒光無需底物或輔因子發(fā)色團是其蛋白質(zhì)一級序列固有的。1962年，下村修等分離純化了水母中發(fā)光蛋白水母素，并發(fā)現(xiàn)一種綠色的熒光蛋白。1974年，他們分離得到了這個蛋白，當(dāng)時稱綠色蛋白，以后稱綠色熒光蛋白(GFP)[1]GFP作為

4、一種新的報告基因，其優(yōu)點在于①熒光強度高，穩(wěn)定性高；②GFP分子量小，易于融合，適用于多種轉(zhuǎn)化方式，對受體無毒害，安全可靠；③不需要反應(yīng)底物與其他輔助因子，受藍光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光，尤其適用于體內(nèi)的即時檢測；④GFP不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細胞中都表達；⑤通過替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應(yīng)不同的研究需要。近年來廣泛用于基因的表達與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細胞的分

5、離與純化等研究領(lǐng)域[2～3]。采用GFP作為標(biāo)記基因，可直接收集轉(zhuǎn)化細胞供實驗，縮短了篩選時間、減少對細胞活性的影響并可作為活體標(biāo)記，為研究發(fā)育的基因調(diào)控和分子機制提供了一種簡潔有效的手段[4、5]。采用基因工程手段生產(chǎn)GFP標(biāo)記的方法，可建立一種簡便、快速的免疫診斷技術(shù)[6]。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌（Escherichiacoli）感受態(tài)細胞是分子克隆的關(guān)鍵步驟[7]，是基因克隆以及DNA文庫構(gòu)建等研究中一項重要的常規(guī)操作。目前，感受態(tài)

6、細胞的制備主要采用CaCl2法，該方法操作簡單、容易掌握、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化率高，可廣泛應(yīng)用于一般的實驗室。其原理是Ca2破壞細胞膜上的脂質(zhì)陣列，并與膜上多聚羥基丁酸化合物、多聚無機磷酸形成復(fù)合物以利于外源DNA的滲入[8]。大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點[9]。而且其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，表達