綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)

1、綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá),概覽,GFPpEGFP-N3和pET-28a實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)過程,GFP,綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein,簡(jiǎn)稱GFP),GFP,基因來源于Jellyfish Aequorea Victoria， 是Shimomura等于1962年發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，由238個(gè)氨基酸組成，分子量約為27Kd。GFP在包括熱、極端PH和化學(xué)變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定

2、在熒光顯微鏡下，用波長(zhǎng)約490 nm的紫外線激發(fā)后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡(jiǎn)捷、便于檢測(cè)； 無需任何的作用底物或共作用物,檢測(cè)的靈敏度不受反應(yīng)效率的影響，保證了極高的檢出率； 蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定； 可在多種異源生物中表達(dá)且無細(xì)胞毒性； 其基因片段長(zhǎng)度較小(約717 bp)，易于構(gòu)建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP，使其產(chǎn)生的熒光較普通GFP強(qiáng)35倍，大大增強(qiáng)了其報(bào)告基因的敏感度。EGF

3、P與其他蛋白的融合表達(dá)已有很多成功的例子。,GFP,絲氨酸－酪氨酸－甘氨酸 生色基團(tuán)蛋白質(zhì)折疊，生色基團(tuán)得以“親密接觸”, 經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮,并發(fā)生脫水反應(yīng)。但此時(shí)還不能發(fā)射熒光,只有當(dāng)有分子氧存在的條件下,發(fā)生氧化脫氫,方能導(dǎo)致綠色熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的“成熟”,形成可發(fā)射熒光的形式。,GFP,藍(lán)光、綠光與黃光基因克隆變體,GFP,分子標(biāo)記藥物篩選融合抗體生物傳感器信號(hào)傳導(dǎo),,標(biāo)記！,pEGFP-N3,真核細(xì)胞表達(dá)載體，pE

4、GFP-N3載體上攜帶有EGFP蛋白表達(dá)基因很強(qiáng)的復(fù)制能力高效的功能強(qiáng)大的啟動(dòng)子SV40和PCMV多克隆位點(diǎn)具有neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細(xì)胞,pEGFP-N3,pET-28a,pET系統(tǒng)（pET-28a）,原核蛋白表達(dá)引用最多的系統(tǒng)在任何E.coli表達(dá)系統(tǒng)中，基礎(chǔ)表達(dá)水平最低真正的調(diào)節(jié)表達(dá)水平的“變阻器”控制提供各種不同融合標(biāo)簽和表達(dá)系統(tǒng)配置具有可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運(yùn)和多肽

5、生產(chǎn)等專用載體和宿主菌許多載體以LIC載體試劑盒方式提供，用于迅速定向克隆PCR產(chǎn)物許多宿主菌株以感受態(tài)細(xì)胞形式提供，可立即用于轉(zhuǎn)化,E.Coli BL21（DE3）表達(dá)菌株,表達(dá)載體和宿主菌的選擇E.Coli BL21（DE3）是表達(dá)宿主菌,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,得到重組質(zhì)粒pET-28a-GFP轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.Coli BL21（DE3）經(jīng)培養(yǎng)后用IPTG進(jìn)行三個(gè)時(shí)間梯度的誘導(dǎo)表達(dá)GFP，紫外線下觀察,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握重組蛋白的基因表

6、達(dá)和蛋白檢測(cè)設(shè)計(jì)思想學(xué)習(xí)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)主要操作技術(shù),實(shí)驗(yàn)原理,實(shí)驗(yàn)器材與儀器,實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)試劑,實(shí)驗(yàn)思路,實(shí)驗(yàn)步驟,將pET-28a-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株· 制備BL21（DE3）菌株的感受態(tài)細(xì)胞 10uL BL21（DE3）菌液接入3mL LB液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)過夜,,二次活化：1:50比例接入新的試管搖床培養(yǎng)2h,,1.5mL冰上10min,,4 度，4000r/min離心2min收集細(xì)

7、胞,,棄培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的Cacl2液600uL，輕懸，冰上20min，4度，4000r/min離心2min,,棄上清液，加入預(yù)冷的Cacl2液500uL，輕懸，冰上5min， 4度，4000r/min離心2min,,棄上清液，加入預(yù)冷的Cacl2液300uL，輕懸，即可,·將pET-28a-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）菌中,300uL分成3份，2份分別加入重組質(zhì)粒2uL，輕勻，冰上30min；1份平行操作（對(duì)照）,,

8、42度水浴熱擊90S，迅速冰上冷卻5min,,兩管中分別加入LB液體培養(yǎng)基100uL，勻，37度振蕩培養(yǎng)30~60min,,涂平板：a）分別取50、100、150uL加入重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞懸液涂布于含抗生素的平板b）抗生素板+IPTG+100uL重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞懸液c）對(duì)照組感受態(tài)細(xì)胞100uL+抗生素平板d）正面向上放置片刻，后37度倒置培養(yǎng)20h,IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),重組陽性克隆菌接至3mL LB（Kan）液體

9、培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)16h,,過夜菌1:50比例接種至4支試管中（每支試管含3mL LB(Kan)），擴(kuò)大培養(yǎng)2h，測(cè)量A600值為0.5，停止,,分別使用IPTG（最后總濃度為1mmol/L）誘導(dǎo)0,2,4h,,離心并照相,Wish a good result!,參考資料,http://baike.baidu.com/view/992207.htmhttp://baike.baidu.com/view/2261117.htm郝福英