產酶溶桿菌Lsp蛋白質與NRPS-PKS基因簇的功能研究.pdf

1、產酶溶桿菌屬于溶桿菌屬、黃單胞科。菌株OH11是本實驗室自主分離鑒定的一種新型生防細菌。HSAF是該菌株中報道的一種結構和作用方式全新的廣譜抗真菌卵菌物質。WAP-8294A2也是該菌株中新發(fā)現的一種抗革蘭氏陽性細菌的活性物質。Ax21蛋白質是黃單胞科病原細菌中新發(fā)現的一種參與致病性的小分子外泌蛋白質。該蛋白質的編碼基因在病原細菌中只有一個拷貝。
　　論文第一章內容主要以Stenotrophomonas maltophilia(S

2、m)中Ax21Sm(Smlt0387)蛋白質作為同源比對的參考序列，通過生物信息學分析，在產酶溶桿菌OH11全基因組中發(fā)現了3個Ax21Sm蛋白質的同系物，將其命名為Lsp1、Lsp2和Lsp3(Lysobacter Small Protein)。這3個蛋白質在氨基酸水平上與Ax21Sm相比分另別具有44％(Lsp1)、26％(Lsp2)和26％(Lsp3)的同源性。它們彼此之間也具有28％(Lsp1與Lsp2)、43％（Lsp2與Ls

3、p3）和34％（Lsp1與Lsp3）的氨基酸序列同源性。此外，與Ax21Sm相似，這3個蛋白質的N端均具有一段保守的分泌型信號肽。單獨缺失這3個lsp基因，發(fā)現野生型OH11合成抗菌物質HSAF和WAP-8294A2的能力顯著下降，表明這3個lsp基因均參與調控這兩種抗菌物質的生物合成。對這3個基因進行組合式雙突變以及三突變，共構建獲得3個雙基因缺失突變株和1個三基因缺失突變株。產量檢測發(fā)現，參試的雙基因和三基因缺失突變中HSAF和WA

4、P-8294A2的產量均顯著下降，但與單基因缺失突變株不存在明顯差異，揭示這3個lsp基因在調控HSAF和WAP-8294A2生物合成方面不存在累積作用。實驗中發(fā)現lsp3基因可以彌補由lsp1和lsp2基因造成的HSAF產量降低的現象，而其它基因則不具備此功能。
　　此外，這3個lsp基因單獨缺失后導致野生型OH11生長緩慢，但不改變野生型產生三種胞外酶（纖維素酶、蛋白酶和幾丁質酶）的能力。
　　本部分首次在黃單胞科生防細

5、菌——產酶溶桿菌中同時克隆了3個Ax21的同系物，并且發(fā)現三者均具有調控次生代謝產物生物合成的功能。且lsp3基因具有彌補lsp1和lsp2造成的HSAF降低的功能。
　　而在第二章中，聚酮類和非核糖體肽類化合物結構多樣、功能強大，是天然產物的兩類代表，分別由聚酮合成酶(PKS)及非核糖體肽合成酶(NRPS)合成。產酶溶桿菌作為一種新型生防菌的典型代表，對多種植物病原菌都有防治效果。此外，產酶溶桿菌還產生了一些抗生素，如抗菌類的W

6、AP-8294A2和抗真菌的HSAF。在OH11基因組中又發(fā)現了四個新的PKS、NRPS和PKS/NRPS雜合基因簇，基因簇命名從A-D。本研究主要從這四個基因簇中選取五個PKS或NRPS基因進行缺失突變，結果顯示:一個PKS(A基因簇)和一個NRPS基因（D基因簇）可以通過WAP-8294A2途徑調控抗菌活性。此外，也證實了PKS、NRPS基因也參與了菌落形態(tài)的調控，但五個突變菌株抗真菌活性均不受影響，也不參與已知抗生素HSAF的生物