產(chǎn)酶溶桿菌OH11中sigma因子的鑒定及功能研究.pdf

1、產(chǎn)酶溶桿菌(Lyso bacter enzymoge nes)屬于黃單胞科(Xanthomonadaceae)、溶桿菌屬(Lysobacter)，是一種重要的革蘭氏陰性生防細(xì)菌。該菌能產(chǎn)生多種胞外酶和小分子抗菌天然產(chǎn)物，對(duì)植物病原真菌及卵菌具有廣譜的抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)室以具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)酶溶桿菌菌株OH11為對(duì)象，從中分離鑒定了一種結(jié)構(gòu)和作用方式新穎，具有廣譜抗真菌卵菌活性的次生代謝產(chǎn)物HSAF(Heat Stable Antifug

2、nal Factor)。除HSAF外，菌株OH11還能利用Ⅳ菌毛(T4P)介導(dǎo)的蹭行運(yùn)動(dòng)(twitching motility，TM)在真菌菌絲上實(shí)現(xiàn)粘附、定殖和侵染。盡管本實(shí)驗(yàn)室已闡明了產(chǎn)酶溶桿菌體內(nèi)HSAF的生物合成途徑并鑒定了TM形成的關(guān)鍵基因，但該菌是如何調(diào)控HSAF合成和TM形成的分子機(jī)制仍不清楚。
　　Sigma(σ)因子是細(xì)菌等原核生物RNA聚合酶上的一個(gè)亞基，可以協(xié)助RNA聚合酶與模板鏈上的啟動(dòng)子專一性的識(shí)別并結(jié)合

3、，極大地提高聚合酶對(duì)DNA啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合力，從而激活或抑制基因的起始轉(zhuǎn)錄。本論文以菌株OH11為對(duì)象，旨在研究sigma因子對(duì)HSAF合成與TM形成的貢獻(xiàn)。
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析，從OH11的全基因組中鑒定了28個(gè)sigma因子，其中27含有σ70結(jié)構(gòu)域(RpoD)，1個(gè)含有σ54結(jié)構(gòu)域(RpoN)。利用基因同源重組技術(shù)，本文構(gòu)建了這27個(gè)sigma因子編碼基因的缺失突變株。通過(guò)HSAF的定量測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)這27個(gè)突變株在HSA

4、F的產(chǎn)量方面與野生型菌株相比均沒(méi)有形成顯著性差異。而后，在TM的檢測(cè)試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)RpoN參與調(diào)控了T4P介導(dǎo)的TM。缺失rpoN后，菌株OH11無(wú)法在菌落邊緣形成運(yùn)動(dòng)細(xì)胞（這是T4P介導(dǎo)的TM的一種指示表型）。電鏡觀察顯示，野生型OH11的細(xì)胞表面形成了多根T4P，但rpoN突變株則完全喪失這一能力。同時(shí)，在同樣的檢測(cè)條件下，其他27個(gè)突變株在其菌落邊緣均能形成清晰可見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，表明在產(chǎn)酶溶桿菌中除RpoN外，其他27個(gè)sigma

5、因子不參與調(diào)控T4P介導(dǎo)的TM。rpoN的互補(bǔ)菌株恢復(fù)了形成TM以及T4P的能力，進(jìn)一步從遺傳學(xué)上確認(rèn)RpoN參與調(diào)控T4P介導(dǎo)的TM。并且我們發(fā)現(xiàn)RpoN在產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株（一株來(lái)自美國(guó)的分離物）中也參與調(diào)控TM的形成，與OH11相似，在C3菌株中突變r(jià)poN后，菌落邊緣將無(wú)法形成運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，揭示RpoN調(diào)控TM的形成可能是不同產(chǎn)酶溶桿菌菌株所采用的一種保守機(jī)制。
　　PilA是已鑒定的T4P形成的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其缺失后OH11

6、完全喪失T4P以及其介導(dǎo)的TM。我們猜測(cè)RpoN是通過(guò)PilA來(lái)調(diào)控TM的。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果表明，在rpoN突變體中，pilA幾乎完全喪失轉(zhuǎn)錄，揭示RpoN可能是通過(guò)調(diào)控pilA的轉(zhuǎn)錄來(lái)控制TM的。與此結(jié)果相吻合，在rpoN突變體中過(guò)表達(dá)pilA后，該突變株能形成TM。進(jìn)一步的細(xì)菌單雜交和EMSA（凝膠阻滯電泳）結(jié)果表明，RpoN在體外不能直接結(jié)合在pilA的啟動(dòng)子區(qū)，揭示RpoN可能是通過(guò)一種間接的機(jī)制來(lái)調(diào)控pilA的轉(zhuǎn)錄。