轉(zhuǎn)G2--aroA基因抗草甘膦棉花植株的獲得及特異性檢測(cè).pdf

1、棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著非常重要的戰(zhàn)略地位。棉田雜草叢生，會(huì)嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量。棉田化學(xué)除草是棉花生產(chǎn)中降低成本、提高經(jīng)濟(jì)效益的根本途徑。草甘膦是一種滅生性除草劑，具有廣譜、高效、低毒和無(wú)殘留的優(yōu)點(diǎn);但是，其在殺滅田間雜草的同時(shí)，也會(huì)傷害農(nóng)作物。利用基因工程技術(shù)，培育和推廣具有草甘膦抗性的棉花新品種，對(duì)于利用草甘膦進(jìn)行棉田化學(xué)除草具有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)可用于商業(yè)化的抗除草劑棉花尚未見(jiàn)報(bào)道。開(kāi)展具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)

2、的抗除革劑轉(zhuǎn)基因棉花的研究，對(duì)我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)具有重大意義。本研究運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦基因G2-aroA轉(zhuǎn)入珂字棉312中，獲得了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉株，并對(duì)其進(jìn)行了抗性鑒定和分子生物學(xué)分析，為該種質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果如下:
　　1.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花的獲得
　　以珂字棉312下胚軸為外檀體，用卡那霉素作為抗性篩選劑，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將菊花Rubisco小亞基基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的G2-aroA

3、基因?qū)肓嗣藁ɑ蚪M中，獲得了10個(gè)轉(zhuǎn)化事件(T0)。這些轉(zhuǎn)化事件，都能正常開(kāi)花結(jié)實(shí)?？敲顾?、草甘膦篩選試驗(yàn)和PCR檢測(cè)、Southern Blot等分子生物學(xué)分析，均證實(shí)G2-aroA基因已成功導(dǎo)入了棉花基因組中。
　　2.轉(zhuǎn)基因棉花后代遺傳分析
　　T0代轉(zhuǎn)基因植株自交種子，種成株行(T1)。田間卡那霉素抗性鑒定結(jié)果，經(jīng)x2卡方檢驗(yàn)，表明各轉(zhuǎn)化子(T1)均符合單位點(diǎn)插入的3∶1分離規(guī)律，與分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致。

4、>　　3.轉(zhuǎn)基因棉花草甘膦抗性鑒定
　　對(duì)田間性狀優(yōu)異的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花BG2-7，用濃度分別為0‰、1‰、2‰、4‰、8‰和10‰的草甘膦溶液，進(jìn)行噴施鑒定。非轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)草甘膦非常敏感，2‰草甘膦（大田推薦施用濃度）處理就全部死亡。轉(zhuǎn)基因棉花，2‰草甘膦處理能夠正常生長(zhǎng);隨草甘膦濃度的增加，轉(zhuǎn)基因棉花的生長(zhǎng)受抑制情況逐漸明顯;10‰草甘膦（5倍大田推薦濃度）處理仍能緩慢生長(zhǎng)，開(kāi)花結(jié)實(shí)。草甘膦抗性鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花BG2

5、-7具有較高的草甘膦抗性。
　　4.轉(zhuǎn)基因棉花BG2-7外源插入基因的側(cè)翼序列分析
　　通過(guò)TAIL-PCR和普通PCR擴(kuò)增，獲得了轉(zhuǎn)基因棉花BG2-7外源DNA插入片段的側(cè)翼序列。本研究所導(dǎo)入的外源基因，插入到了棉花基因組第十一號(hào)染色體上，5'端位于染色體的第61，253，333處;棉花基因組序列與外源基因5'端之間有31 bp的棉花微衛(wèi)星序列;外源基因Leftboder缺失84 bp堿基，Right boder缺失298

6、 bp堿基，棉花基因缺失30 bp堿基;。
　　5.轉(zhuǎn)基因棉花BG2-7特異性檢測(cè)方法的建立
　　依據(jù)獲得的側(cè)翼序列信息，分別設(shè)計(jì)BG2-7轉(zhuǎn)化事件外源基因5'端和3'端特異性PCR檢測(cè)引物。經(jīng)篩選，分別確定引物 GTCATAACGTGACTCCCTTAATTCTCC/CCTATTACACGGCTATGC為特異性PCR5'端檢測(cè)引物，引物TCCTTTCGCTTTCTTCCCTT/ACACTTACATGGCGTCTTCT為3'

7、端檢測(cè)引物，建立了BG2-7轉(zhuǎn)化事件的特異性檢測(cè)方法。5'端的檢測(cè)靈敏度，可以達(dá)到44個(gè)拷貝;3'端的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到88個(gè)拷貝。
　　另外，還依據(jù)側(cè)翼序列信息，設(shè)計(jì)了復(fù)合PCR引物。引物ATGGAAGGGCTGTTGATACA/TCTGACATCATGGATCGCAA擴(kuò)增棉花基因組序列，引物TCGCTTTCTTCCCTTCCTTT/TCTGACATCATGGATCGCAA擴(kuò)增3'端特異性序列，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立了BG2-