人工合成microRNA在大豆疫霉基因沉默中的應(yīng)用.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae）在分類上屬于卵菌，與真菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)而與藻類更為接近。每年由其引起的病害給全球大豆生產(chǎn)帶來(lái)約10-20億美元的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究大豆疫霉的致病分子機(jī)理對(duì)研究其防控手段與策略尤為重要。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)是研究大豆疫霉致病分子機(jī)理的重要手段，外源基因整合到基因組中進(jìn)行表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)源同源基因的沉默。但是，大豆疫霉的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化技術(shù)存在轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化子沉默效率較低、沉默不夠穩(wěn)定的缺點(diǎn)，同

2、時(shí)，外源基因整合到基因組中容易造成整合位點(diǎn)附近的其他基因功能受到影響。因此，優(yōu)化疫霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法是疫霉研究者始終關(guān)注的課題。在過(guò)去的十年中，RNA干擾(RNAi)已經(jīng)成為抑制真核生物基因表達(dá)的廣泛而有效的工具(Hannon，2002)。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)抑制或沉默。利用天然的microRNA骨架作為前體，融合人工設(shè)計(jì)的特異性的小

3、干擾RNA片段，構(gòu)成artificial microRNA(amiRNA)，可用于調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。該方法在擬南芥、水稻和衣藻等物種中都被成功應(yīng)用，具有特異性強(qiáng)、效率高的特點(diǎn)。本研究以大豆疫霉PsGK5、PsCDC14、PsAVR1d、PsAVR3b、PsIMPA等為靶標(biāo)基因，分別設(shè)計(jì)并構(gòu)建了相應(yīng)的amiRNA沉默載體，并對(duì)這些amiRNAs在大豆疫霉基因沉默上的效果進(jìn)行了分析。
　　以大豆疫霉天然miRNA基因miR1a為

4、前體構(gòu)建了靶標(biāo)基因的amiRNA載體。根據(jù)artificial microRNA的設(shè)計(jì)原則，在靶標(biāo)基因的5'端選取序列，能夠避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。選取的序列須符合ACG(N)18T的特征，即:5'端的三個(gè)堿基必須為ACG，3'端的堿基必須為T，中間的18個(gè)堿基可以為任意序列。因此，同一個(gè)靶標(biāo)基因可以有若干種不同的序列選擇。理論上，amiRNA的自由能越低，穩(wěn)定性越差，越容易同RISC形成復(fù)合體，沉默效率也就越高。計(jì)算候選的靶標(biāo)序列自由能，

5、選取自由能最低的序列構(gòu)建amiRNA載體。將選取的堿基序列ACG(N)18T輸入程序amiRNA primercreator，設(shè)計(jì)4條引物，通過(guò)重疊PCR構(gòu)建amiRNA。根據(jù)以上設(shè)計(jì)原則，我們構(gòu)建了pTOR::GK5ami-1、pTOR::GK5ami-2、pTOR::GK5ami1-2、pTOR::CDC14ami-1、pTOR::CDC14ami-2、pTOR::CDC14ami1-2、pTOR::AVR3b ami以及pTOR:

6、:AVR1d ami8個(gè)amiRNA沉默載體，用以驗(yàn)證其沉默效率。pTOR:: PsIMPA ami用于比較穩(wěn)定沉默與amiRNA介導(dǎo)的基因沉默的沉默效率。
　　AmiRNA介導(dǎo)大豆疫霉基因沉默的效率分析。通過(guò)PEG-CaCl2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)將p TOR::GK5ami-1、pTOR::GK5ami-2、pTOR::GK5ami1-2、pTOR::CDC14ami-1、pTOR::CDC14ami-2、pTOR::CDC14ami

7、1-2、pTOR::AVR3b ami以及pTOR::AVR1d ami導(dǎo)入大豆疫霉的原生質(zhì)體，每個(gè)amiRNA載體隨機(jī)挑選出28個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行沉默效率的驗(yàn)證以及沉默突變體的表型分析。我們發(fā)現(xiàn)，amiRNA介導(dǎo)的大豆疫霉基因沉默的沉默效率在40％～70％;并且，對(duì)于PsIMPA的研究發(fā)現(xiàn)沉默突變體的篩選效率要比傳統(tǒng)的疫霉穩(wěn)定轉(zhuǎn)化高。通過(guò)對(duì)PsGK5、PsCDC14、PsAVR3b和PsAVR1d沉默突變體表型分析，發(fā)現(xiàn)上述基于amiRNA