大豆疫霉卵孢子發(fā)育早期特異表達基因的篩選及分析.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthorasojae）是一種土傳危害性的植物病原菌，由其引起的大豆根腐病能對大豆生產(chǎn)產(chǎn)生極大危害。目前的研究表明該病原菌的致病性易變，新的抗病品種會由于新的致病小種的出現(xiàn)而失去對大豆疫霉病的防治作用。因此，大豆疫霉根腐病如何能夠有效的防治始終是大豆生產(chǎn)上的難題，而通過了解其生長發(fā)育與致病過程的相關(guān)分子機制，發(fā)現(xiàn)其生長與致病過程的關(guān)鍵基因，利用這些基因作為分子靶標，從而能夠開發(fā)有效的病原菌防治策略。轉(zhuǎn)錄因子在真核生

2、物的生命活動中扮演著重要的角色，通過開啟或關(guān)閉某個或某些基因在特定時期的表達，來調(diào)控生物有機體的特征與性狀，闡明大豆疫霉菌生長發(fā)育與致病性的關(guān)鍵是在基因組水平上了解基因的表達與調(diào)控，借助轉(zhuǎn)錄因子的研究有利于對大豆疫霉菌細胞內(nèi)基因調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)和作用機制的理解。
　　 利用抑制差減雜交法對大豆疫霉有性發(fā)育初期特異表達基因進行篩選，共篩選出183個序列，經(jīng)點雜交分析發(fā)現(xiàn)，其中41個unigene在卵孢子形成階段上調(diào)表達。說明這些基因在參

3、與卵孢子發(fā)育初期階段的調(diào)控，通過大豆疫霉數(shù)據(jù)庫的檢索發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白質(zhì)涉及能量合成、蛋白質(zhì)合成、細胞信號傳導(dǎo)、細胞壁的生成和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。選擇感興趣的11個基因，利用RT-PCR測定其在大豆疫霉不同生長階段的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有8個基因只在卵孢子形成階段表達，而MybDNA-bindingdomaingene,hypotheticalproteingeneandTubulin-tyrosineligasegene等3個基因在初始

4、即檢測到表達，說明這三個基因?qū)β焰咦拥脑缙诎l(fā)育可能起著關(guān)鍵的作用。
　　 利用基因沉默表達技術(shù)對一個可能參與卵孢子發(fā)育的大豆疫霉基因PsMyb1進行了功能分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因含有2個內(nèi)含子，分別位于其啟始密碼子下游的第358和469堿基處，大小分別為73bp和78bp，根據(jù)堿基序列翻譯后的蛋白質(zhì)由605個氨基酸殘基組成，含有一個“SHLQKYR”(Ser-His-Leu-Gln-Lys-Tyr-Arg)保守序列。系統(tǒng)發(fā)育分

5、析表明，該轉(zhuǎn)錄因子多存在于植物中，且系統(tǒng)發(fā)育樹中還發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子在大豆疫霉和植物中的遺傳距離較遠。利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，將PsMyb1進行轉(zhuǎn)錄基因沉默分析。轉(zhuǎn)錄水平的研究發(fā)現(xiàn)，相對于野生型，PsMyb1基因沉默突變體中PsMyb1的相對表達水平明顯下降。表型分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，PsMyb1基因沉默突變體中卵孢子的形成受到影響，當(WT)野生型的卵孢子產(chǎn)量為260-270個，PsMyb1沉默突變體的卵孢子產(chǎn)量為10-30個，表明沉默突