細(xì)胞遷移誘導(dǎo)蛋白在前列腺癌失巢凋亡耐受細(xì)胞轉(zhuǎn)移和代謝中的作用研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分:
　　第一部分:前列腺癌失巢凋亡耐受細(xì)胞模型的建立及生物學(xué)行為研究
　　目的：建立前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡耐受模型并探究其失巢凋亡抵抗、遷移、侵襲、代謝相關(guān)生物學(xué)行為。
　　方法：應(yīng)用超低粘附培養(yǎng)板持續(xù)懸浮培養(yǎng)前列腺癌PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞7天，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至普通培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)2天，能夠存活并貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞即認(rèn)為是失巢凋亡耐受細(xì)胞。采用FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC-3、DU145親本細(xì)胞和

2、失巢凋亡耐受細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)48小時(shí)的凋亡水平。采用Transwell法檢測(cè)PC-3、DU145親本細(xì)胞和失巢凋亡耐受細(xì)胞的遷移和侵襲能力。應(yīng)用生化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PC-3、DU145親本細(xì)胞和失巢凋亡耐受細(xì)胞丙酮酸、乳酸和ATP水平。應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC-3、DU145親本細(xì)胞和失巢凋亡耐受細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）以及代謝相關(guān)蛋白丙酮酸脫氫酶激酶4（PDK4）、乳酸脫氫酶A（LD

3、HA）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)48小時(shí)后的凋亡率較各自的親本細(xì)胞明顯降低。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細(xì)胞在遷移數(shù)量上較相應(yīng)的親本細(xì)胞明顯增加；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細(xì)胞的侵襲能力較各自的親本細(xì)胞明顯增強(qiáng)。生化檢測(cè)結(jié)果顯示，失巢凋亡耐受的PC-3和DU1

4、45細(xì)胞的丙酮酸、乳酸和ATP水平較各自的親本細(xì)胞明顯升高。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2、VEGF及代謝相關(guān)蛋白PDK4、LDHA表達(dá)水平較各自的親本細(xì)胞明顯增加。
　　結(jié)論：失巢凋亡耐受的前列腺癌細(xì)胞較親本細(xì)胞的抗失巢凋亡能力和遷移侵襲能力明顯增強(qiáng)，可能與失巢凋亡耐受細(xì)胞MMP2和VEGF表達(dá)升高有關(guān)。失巢凋亡耐受的前列腺癌細(xì)胞較親本細(xì)胞出現(xiàn)更明顯的代謝重編程現(xiàn)象，表現(xiàn)為

5、細(xì)胞的丙酮酸、乳酸和ATP水平顯著上升，可能與失巢凋亡耐受細(xì)胞PDK4和LDHA表達(dá)升高有關(guān)。
　　第二部分:前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡耐受過(guò)程中細(xì)胞遷移誘導(dǎo)蛋白的篩選與驗(yàn)證
　　目的：篩選并驗(yàn)證在前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡耐受過(guò)程中與細(xì)胞轉(zhuǎn)移和能量代謝相關(guān)的潛在分子靶點(diǎn)。
　　方法：應(yīng)用人類全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)發(fā)掘在前列腺癌親本和失巢凋亡耐受的PC-3細(xì)胞中表達(dá)具有顯著差異的基因，結(jié)合差異基因GO富集分析、KEGG通路富集分析

6、篩選出10個(gè)候選基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道確定目標(biāo)基因，用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在親本和失巢凋亡耐受的PC-3與DU145細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況。最后用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析含有90對(duì)接受根治性前列腺切除術(shù)患者的腫瘤和癌旁組織標(biāo)本的組織芯片中目標(biāo)基因的表達(dá)情況，分析其與前列腺癌臨床進(jìn)展的關(guān)系。
　　結(jié)果：人類全基因組表達(dá)譜芯片分析結(jié)果顯示在前列腺癌親本與失巢凋亡耐受的PC-3細(xì)胞中共有2370個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中11

7、83個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，1187個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。定量PCR結(jié)果證實(shí)在失巢凋亡耐受的PC-3細(xì)胞中CYB5R2、SERPINE2、CEMIP、CCL2、ETV5等5個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，而LGSN、ENPP1、SORBS2、DCN、CSPG4等5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明在失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細(xì)胞中細(xì)胞遷移誘導(dǎo)蛋白（CEMIP）及其上游β連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)均顯著升高。組織芯片結(jié)果顯示，CEMI

8、P在前列腺腫瘤組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯增加且二者具有相關(guān)性。
　　結(jié)論：CEMIP在前列腺癌失巢凋亡耐受細(xì)胞中的表達(dá)較親本細(xì)胞明顯增加，并且可能與腫瘤的臨床進(jìn)展相關(guān)。
　　第三部分:細(xì)胞遷移誘導(dǎo)蛋白在前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡耐受中的生物學(xué)作用和表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究
　　目的：探究CEMIP在前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡耐受過(guò)程中的生物學(xué)作用及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用CEMIP的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)

9、粒轉(zhuǎn)染失巢凋亡耐受的PC-3和DU145細(xì)胞。采用PE/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照細(xì)胞（NC）和干擾了CEMIP表達(dá)的細(xì)胞（CEMIP-KO）在懸浮培養(yǎng)48小時(shí)的凋亡水平，采用Transwell法檢測(cè)NC和CEMIP-KO細(xì)胞的遷移和侵襲能力。應(yīng)用生化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NC和CEMIP-KO細(xì)胞丙酮酸、乳酸及ATP水平。應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NC和CEMIP-KO細(xì)胞MMP2、VEGF、PDK4和LDHA的表達(dá)情況。將PC-3和DU1

10、45細(xì)胞分別懸浮培養(yǎng)1、3、5、7天后用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞總AMPKα和p-AMPKα蛋白表達(dá)水平；以AMPK通路抑制劑Dorsomorphin處理失巢凋亡耐受的前列腺癌細(xì)胞后，用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞p-AMPKα、p-GSK3β、β-catenin和CEMIP的蛋白表達(dá)水平。用小干擾RNA沉默失巢凋亡耐受的PC-3細(xì)胞β-catenin的表達(dá)后，蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞β-catenin和CEMIP的蛋白表達(dá)水平；用W

11、nt/β-catenin通路抑制劑XAV939處理失巢凋亡耐受的DU145細(xì)胞，以蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞β-catenin和CEMIP的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除失巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)胞的CEMIP表達(dá)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示CEMIP-KO細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)48小時(shí)的凋亡率較NC細(xì)胞明顯升高，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CEMIP-KO細(xì)胞的遷移、侵襲能力較NC細(xì)胞顯著下降；生化檢測(cè)結(jié)果表明C

12、EMIP-KO細(xì)胞的丙酮酸、乳酸和ATP水平較NC細(xì)胞明顯降低。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CEMIP-KO細(xì)胞MMP2、VEGF、PDK4和LDHA的蛋白表達(dá)水平較NC細(xì)胞顯著減少。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果表明前列腺癌細(xì)胞p-AMPKα蛋白表達(dá)水平隨懸浮培養(yǎng)時(shí)間增加而升高，重貼壁后p-AMPKα表達(dá)有所下降但仍明顯高于親本細(xì)胞，各組總AMPKα的表達(dá)無(wú)明顯變化；當(dāng)用Dorsomorphin抑制AMPKα表達(dá)后，失巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)胞的p-G

13、SK3β、β-catenin和CEMIP蛋白表達(dá)水平隨p-AMPKα的表達(dá)顯著降低。用小干擾RNA或XAV939抑制失巢凋亡耐受細(xì)胞的β-catenin后CEMIP蛋白表達(dá)水平隨之明顯降低。
　　結(jié)論：CEMIP通過(guò)調(diào)控失巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)胞MMP2和VEGF的蛋白表達(dá)影響其失巢凋亡抵抗、遷移和侵襲能力，并通過(guò)調(diào)控失巢凋亡耐受前列腺癌細(xì)胞PDK4和LDHA的蛋白表達(dá)影響其代謝重編程效應(yīng)。AMPK/GSK3β/β-catenin信