人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、前列腺癌是歐美國家最常見的男性惡性腫瘤之一,占男性癌癥死因的第二位。我國前列腺癌發(fā)病率雖遠(yuǎn)低于西方國家,但近來隨著人口老齡化及生活條件的改善,發(fā)病率呈顯著增長趨勢(shì)。骨骼是最常見的前列腺癌轉(zhuǎn)移的靶器官,超過80％的前列腺癌患者會(huì)發(fā)生以成骨性表現(xiàn)為主的骨轉(zhuǎn)移。骨轉(zhuǎn)移確切的發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有分化為多種中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞(成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞)的能力,并且對(duì)腫瘤侵襲、生長有重要影響。因此

2、,研究人MSCs(hBMSCs)與前列腺癌細(xì)胞相互作用對(duì)于闡明前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制以及創(chuàng)新前列腺癌的治療方法具有重要意義。 首先,本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合方法分離hBMSCs。分離3天后換液去除未貼壁細(xì)胞,第4天可見分裂中的成纖維樣貼壁細(xì)胞,第6d可見多個(gè)細(xì)胞克隆形成,第10d可見細(xì)胞呈均一的成纖維樣細(xì)胞形態(tài),呈多向螺旋生長,80％克隆匯合形成單細(xì)胞層。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá):CD29為99.64％,C

3、D14為1.01％,CD45為0.89％,CD44為99.91％,CD90為95.04％,CD34為0.32％,CD166為82.55％,CD105為98.89％,HLA-DR為1.27％,HLA-ABC為98.69％。成骨誘導(dǎo)分化第14d堿性磷酸酶(ALP)染色顯示細(xì)胞內(nèi)大量紫紅色顆粒形成,第21d Von Kossa染色顯示鈣鹽沉積。脂肪誘導(dǎo)分化第8d,油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)大量脂肪滴形成。根據(jù)目前MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)分離、培養(yǎng)h

4、BMSCs獲得成功。依據(jù)如下：1、從人骨髓分離、培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞呈貼壁生長,呈成纖維細(xì)胞樣外觀；2、CD29、CD44、CD90、CD166、CD105和HLA-ABC表達(dá)陽性,CD14、CD45、CD34和HLA-DR表達(dá)陰性；3、可以被定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。 其次,本實(shí)驗(yàn)探討了hBMSCs對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞遷移、侵襲作用的影響及機(jī)制。1、采用Boyden Chamber法檢測(cè)PC-3細(xì)胞遷移、侵襲能力。檢測(cè)遷移

5、能力時(shí),將PC-3細(xì)胞接種在上室,下室根據(jù)培養(yǎng)液不同分兩組。Ⅰ組:PC-3培養(yǎng)基；Ⅱ組：含50％hBMSCs條件培養(yǎng)液的PC-3培養(yǎng)基。24h后棉簽擦去上室膜上細(xì)胞,HE染色,鏡下200倍視野記數(shù)細(xì)胞。檢測(cè)侵襲能力時(shí)在上室聚碳酸酯膜上鋪一層Matrigel膠,其余同遷移檢測(cè)。2、應(yīng)用real-time RT-PCR和western blot法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2,9(MMP-2,9)的表達(dá)。根據(jù)培養(yǎng)液不同分兩組。A組:PC-3培養(yǎng)基；

6、B組：含50％hBMSCs條件培養(yǎng)液的PC-3培養(yǎng)基。24h后收集細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果顯示：1、A、B兩組細(xì)胞遷移數(shù)分別為225.33±21.60和325.1±21,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-5.73,P=0.0046<0.01);A、B兩組細(xì)胞侵襲數(shù)分別為110.67±11.68和245.33±11.50,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-14.23,P=0.0001<0.01)。2、MMP-2 mRNA表達(dá)量(RQ值)：兩組分別為0.96±0.04和

7、1.19±0.05,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-5,98,P=0.0039<0.01);MMP-2蛋白表達(dá)量(RGS)：兩組分別為0.50±0.12和1.04±0.18,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=4.19,P=0.0138<0.05)。3、MMP-9 mRNA表達(dá)量(RQ值)：兩組分別為10.67±0.984和25.40±1.32,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-15.49,P=0.0001<0.01);MMP-9蛋白表達(dá)量(RGS)兩組分別為0.17

8、±0.01和0.46±0.07,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=7.49,P=0.0017<0.01)。結(jié)果顯示hBMSCs增強(qiáng)前列腺癌PC-3細(xì)胞遷移、侵襲能力,該作用可能與PC-3細(xì)胞MMP-2,9表達(dá)增加有關(guān)。 第三,本實(shí)驗(yàn)研究了前列腺癌PC-3細(xì)胞與hBMSCs相互之間對(duì)生長的影響。將hBMSCs細(xì)胞分為兩組。Ⅰ組：對(duì)照組(hBMSCs培養(yǎng)基);Ⅱ組:PC-3條件培養(yǎng)液組(含50％PC-3條件培養(yǎng)液的hBMSCs培養(yǎng)基)。將PC-

9、3細(xì)胞分為兩組。A組：對(duì)照組(PC-3培養(yǎng)基);B組:hBMSCs條件培養(yǎng)液組(含50％hBMSCs條件培養(yǎng)液的PC-3培養(yǎng)基)。用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞第1-7d活性。第4d流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化和透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：1、PC-3對(duì)hBMSCs生長的影響。Ⅰ組細(xì)胞第1-7d的光密度值(OD)分別為0.41±0.02、0.53±0.04、0.66±0.01、0.96±0.02、1.37±0.02、1.72±0.03和1.7

10、9±0.01;Ⅱ組細(xì)胞第1-7d的OD值分別為0.44±0.03、0.64±0.01、0.80±0.02、1.26±0.01、1.91±0.06、2.20±0.04和2.30±0.06。兩組間對(duì)應(yīng)比較除第1d無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-1.48,P=0.21>0.05)外,其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。I、II兩組第4d細(xì)胞周期(％):G0/G1期分別為62.11±1.15和50.63±0.54,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=12.76,P=0.

11、0061<0.01);S+G2/M期分別為37.90±1.15和49.36±0.54,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-12.74,P=0.0061<0.01);電鏡觀察:Ⅰ組細(xì)胞細(xì)胞核漿比例大,核仁較大,細(xì)胞器稀少:Ⅱ組細(xì)胞核質(zhì)比例較小,核不規(guī)則,核仁較小,胞質(zhì)中有豐富的細(xì)胞器,如核糖體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體等。2、MSCs對(duì)PC-3生長的影響。A組細(xì)胞第1-7d的光密度值(OD)分別為0.116±0.01、0.208±0.004、

12、0.405±0.04、0.845±0.01、1.404±0.01、1.957±0.01和2.08±0.05:B組細(xì)胞第1-7d的OD值分別為0.120±0.02、0.285±0.006、0.617±0.01、1.111±0.03、1.625±0.02、2.277±0.01和2.283±0.01。兩組間對(duì)應(yīng)比較除第1d無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.07,P=0.797>0.05)外,其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。A、B兩組第4d細(xì)胞周期(％

13、):G0/G1期分別為68.54±1.21和56.20±0.78,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=12.13,P=0.0067<0.01);S+G2/M期分別為31.46±1.20和43.80±0.77,比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-12.22,P=0.0066<0.01);電鏡觀察:A組細(xì)胞核質(zhì)比例較大,核呈橢圓形,僅含1個(gè)核仁,染色質(zhì)分布稀疏,電子密度較低,胞質(zhì)細(xì)胞器稀少；B組細(xì)胞核質(zhì)比例較小,核呈不規(guī)則形,有核袋及核突,含2-3個(gè)核仁。胞質(zhì)中有豐

14、富的細(xì)胞器,如核糖體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體等。結(jié)果顯示PC-3細(xì)胞與hBMSCs相互促進(jìn)增殖,其機(jī)制是G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)換加快。 最后,本實(shí)驗(yàn)探討了前列腺癌PC-3細(xì)胞對(duì)hBMSCs成骨分化的影響。收集PC-3細(xì)胞上清液作為條件培養(yǎng)基。將hBMSCs分為四組。Ⅰ組：對(duì)照組(hBMSCs培養(yǎng)基);Ⅱ組:PC-3條件培養(yǎng)液培養(yǎng)組(含50％PC-3條件培養(yǎng)液的hBMSCs培養(yǎng)基);Ⅲ組：成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)組；IV組：含PC-3

15、條件培養(yǎng)液的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)組(含50％PC-3條件培養(yǎng)液的成骨誘導(dǎo)液)。第14d行ALP染色和ALP活性定量檢測(cè),第21d行Von Kossa鈣染色和鈣定量檢測(cè)。結(jié)果：1、ALP活性定量(U/mg protein)：第14d各組分別為：0.29±0.03、1.30±0.03、2.13±0.07和3.80±0.03。組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)2、鈣沉積定量(μmol/well)：第21d各組分別為：0.04±0.01、0.44±