基于TMT技術的關于彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥的血清蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、背景及目的：彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(Diffuse Idiopathic Skeletal Hyperostosis,DISH),也稱為彌漫性特發(fā)性骨肥大,是一類肌腱附著點炎及相應的韌帶出現(xiàn)骨化、鈣化及在骨骼附著部有新骨形成為主要表現(xiàn)的骨病,主要涉及的多發(fā)部位包括脊柱、骨盆,另外常常侵犯跟骨、髕骨等處。DISH的診斷目前仍為影像學診斷,雖然由于不同作者根據(jù)不同的的骨橋形成情況而納入的標準不同,其報道的患病率也各不相同,但總體發(fā)病率均隨著年

2、齡的增長而持續(xù)性地增高。由于本病的發(fā)病機制目前尚不明確,因此本病的診斷手段仍然停留在影像學檢查這一單一方式上,但DISH早期的影像學表現(xiàn)有可能并不突出,未必能夠引起足夠的重視從而造成漏診。本研究是通過差異蛋白質(zhì)組學的方法,采用蛋白標簽定量技術(Tandem Mass Tag,TMT)、聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析,對DISH患者

3、的血清中存在的相對于正常人的差異表達蛋白質(zhì)進行篩選和鑒定,結合蛋白質(zhì)功能的生物信息網(wǎng)絡等研究成果,對所鑒定的蛋白質(zhì)在DISH發(fā)生發(fā)展中的作用進行分析研究。以期尋找DISH發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)的特異差異蛋白,為臨床篩查和診斷DISH提供某種血清蛋白標記物,并為進一步研究DISH的發(fā)病機理、尋找診斷及藥物治療靶點、疾病預后判斷甚至易感人群的判定等提供研究基礎。
　　方法：1)根據(jù)特異度較高的Resnick關于DISH的診斷標準,采集1

4、0例彌漫性特發(fā)性骨肥厚癥(DISH)患者,以及10例年齡相近、性別匹配的正常人(經(jīng)影像學檢查排除DISH等異常骨質(zhì)增生的情況)的空腹靜脈血。經(jīng)低溫離心后獲取血清分裝標識,并于-80℃條件保存。所有血清經(jīng)過去除高峰度蛋白后進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳),然后進行蛋白膠內(nèi)酶解,用胰蛋白酶(Trypsin)消化蛋白得到肽段。用TMT進行標記,TMT6-127用于標記對照組,TMT6-131用于標記DISH組。將標記好

5、的肽段混合后經(jīng)過除鹽除雜質(zhì)處理,通過Dionex Ultimate 3000納升液相色譜儀聯(lián)合Q-Exactive質(zhì)譜儀進行LC-MS/MS檢測分析。數(shù)據(jù)用Xcalibur 2.1.2 software進行分析。搜庫軟件為Proteome Discoverer,采用SEQUEST HT檢索算法,譜圖檢索Swissprot Human數(shù)據(jù)庫。根據(jù)不同TMT試劑報告離子的相對豐度來進行肽段相對定量,并根據(jù)肽段相對定量結果統(tǒng)計出蛋白的相對定量

6、結果。同一蛋白在某一組相對于另一組的比值(Ratio),認為確定比值變化超過1.3倍,即大于1.3為上調(diào),小于0.75為下調(diào),被認為有顯著性差異,而其它肽段離子用來做蛋白鑒定。2)將鑒定出的所有差異蛋白進行生物信息學分析,預測差異蛋白在生物網(wǎng)絡中的關系,進一步篩選認為有意義的蛋白。
　　結果：共找到425個蛋白,score大于5的有253個,有定量信息的蛋白185個,其中,上調(diào)大于1.3倍的17個,下調(diào)小于0.75倍的56個;sc

7、ore大于5分并且沒有定量信息的蛋白有68個,發(fā)現(xiàn)其中Ig alpha-2 chain C region和Isoform H14of Myeloperoxidase(MPO)這兩個蛋白只在DISH病人血清中存在。對能夠定量的蛋白進行生信分析,發(fā)現(xiàn)在下調(diào)蛋白中有15個蛋白都參與到對刺激的響應中,包括extracellular superoxide dismutase[Cu-Zn](細胞外過氧化物歧化酶)和蛋白glutathione per

8、oxidase(谷胱甘肽過氧化物酶,GPx3)。在下調(diào)蛋白中,通過KEGG信號通路分析,可以看到參與PPAR信號通路的三個蛋白PLTP、APO-AI和APO-AII都有明顯的下調(diào)。通過生物信息學分析推斷認為DISH患者可能參與脂蛋白代謝的PPAR通路受到影響,從而導致了處于該通路上下游的MPO、PLTP、APO-AI和APO-AII出現(xiàn)變化。
　　結論：1、本研究是首次采用串聯(lián)質(zhì)譜標簽蛋白定量技術、聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析,對DI

9、SH患者的血清進行差異蛋白質(zhì)組學研究。摸索并確立了DISH患者血清TMT-LC-MS/MS實驗研究的技術路線。2、對DISH的特異血清標記物和發(fā)病機制進行了初步的探索,建立了DISH患者的血清差異蛋白質(zhì)組資料庫。發(fā)現(xiàn)了DISH患者血清中相對于正常人具有顯著變化的可定量蛋白、以及幾種DISH患者血清中獨有的無定量信息蛋白。3、通過本次研究,我們在通過蛋白質(zhì)組學研究的基礎上對所篩選的蛋白進行生物信息學分析,通過分析在同一信號通路中出現(xiàn)的多種