EGFR-FGFR雙靶點(diǎn)抑制劑D3的抗肺癌活性的研究.pdf

1、目的:肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，而其中非小細(xì)胞肺癌又占據(jù)了大多數(shù)。大約有10％～30％腫瘤患者有表皮生長因子受體突變，而臨床上都用EGFR抑制劑治療這種EGFR突變的腫瘤。雖然這種靶向?qū)τ贓GFR突變的病人很有效，但是最終都會產(chǎn)生獲得性耐藥。而更重要的是由于在EGFR-TKI耐藥過程中，觸發(fā)了其他促增殖的受體酪氨酸激酶信號通路的激活，如FGFR和ALK通路等，因而即使EGFR被抑制，腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控信號已經(jīng)轉(zhuǎn)向了其他通路。目前已有

2、研究揭示FGF/FGFR的自分泌環(huán)的活化是促進(jìn)阿法替尼耐藥細(xì)胞存活和生長的補(bǔ)償機(jī)制之一。因此，F(xiàn)GFR和EGFR雙重抑制劑的研發(fā)特別是針對非小細(xì)胞肺癌及其耐藥治療具有重要的研究意義和前景。在本研究中，我們評價(jià)了自己合成的化合物D3這個(gè)EGFR/FGFR雙靶點(diǎn)抑制劑的體內(nèi)外抗腫瘤效果，同時(shí)探討了D3通過抑制腫瘤細(xì)胞的EGFR以及下游信號通路同時(shí)也抑制FGFR旁路系統(tǒng)，從而抑制腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展和逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制。
　　方法:
　　

3、1.激酶層面，利用ELISA方法初步評價(jià)我們合成的化合物對EGFR激活突變的活性，接著，對FGFR家族激酶和其他激酶進(jìn)行進(jìn)一步的的實(shí)驗(yàn)觀察其是否具特異性。
　　2.在細(xì)胞層面，利用Western Blot法來觀察化合物D3在細(xì)胞中對EGFR和FGFR及其下游信號傳導(dǎo)途徑的抑制活性;在化合物作用2小時(shí)后我們撤掉并給予新鮮的培養(yǎng)基以去除培養(yǎng)基中的化合物，此時(shí)記為0小時(shí)，收集撤藥0小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)和12小時(shí)后的蛋白進(jìn)行不可逆驗(yàn)證;利

4、用MTS法測定化合物對多種NSCLC細(xì)胞系作用72小時(shí)后的抗增殖作用及對正常細(xì)胞的毒性;利用流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL、Caspase3來觀察化合物對H1975細(xì)胞系作用24小時(shí)后對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。
　　3.在動(dòng)物層面，將裸鼠接種H1975腫瘤細(xì)胞，在腫瘤達(dá)到一定體積時(shí)將動(dòng)物分為5組，分別是溶劑組、D3組、WZ4002組、AZD4547組以及WZ4002和AZD4547聯(lián)合給藥組，并定期記錄老鼠體重和腫瘤體積。對腫瘤組織進(jìn)行Wes

5、tern Blot分析。
　　結(jié)果:
　　1.體外的實(shí)驗(yàn)表明D3無論是在激酶層面還是細(xì)胞層面，化合物D3不僅具有對突變的EGFR激酶有抑制活性作用，對FGFR1激酶也有很強(qiáng)的抑制活性作用。而且D3能抑制EGFR和FGFR以及下游信號通路的磷酸化。在NCI-H1975細(xì)胞株上化合物D3可以同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的EGFR和它下游信號通路的磷酸化和FGFR旁路系統(tǒng)，從而達(dá)到抑制腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展和逆轉(zhuǎn)耐藥的效果。
　　2.體內(nèi)的數(shù)

6、據(jù)證明化合物D3對含有EGFR L858R/T790M突變以及FGFR高表達(dá)的NCI-H1975異種移植模型的抗腫瘤作用。尤其需要強(qiáng)調(diào)的是，在H1975異種移植模型中，與造模組相比，化合物D3在為10mg/kg劑量下引起腫瘤消退的能力優(yōu)于同等劑量單獨(dú)給予AZD4547和WZ4002陽性藥組，與AZD4547和WZ4002聯(lián)合給藥組沒有顯著性差異，且沒有產(chǎn)生明顯的體重變化。隨后的腫瘤組織的Western Blot分析結(jié)果與腫瘤體積的結(jié)果趨