IL-24突變體的構建及其泛素化位點的確定.pdf

1、目的:尋找IL-24泛素化位點,獲得去泛素化的IL-24突變體,為臨床應用去泛素化IL-24突變體治療惡性腫瘤奠定實驗基礎。
　　 方法:
　　 1.利用基因定點突變技術,以pcDNA3.1(+)-IL-24為模板,將IL-24第63、69、78、119、123、136、179、189、203、206潛在的泛素結合位點的賴氨酸密碼子突變成精氨酸密碼子,測序鑒定正確,從而構建10個IL-24的突變體質粒。
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2、.pcDNA3.1(+)-IL-24及10個IL-24突變體質粒轉染人宮頸癌細胞株Hela和人肝癌細胞株HepG2,以沒有轉染的細胞作為空白對照,48小時后裂解細胞收集蛋白,以IL-24抗體作為一抗做Western blot實驗,檢測IL-24蛋白表達。
　　 3.pcDNA3.1(+)-IL-24及10個IL-24突變體質粒轉染Hela細胞和HepG2細胞,以沒有轉染的細胞作為空白對照,48小時后裂解細胞,細胞裂解液與IL-2

3、4一抗共孵育,用A/G Plus-Agarose珠子吸附結合有IL-24的蛋白質,接著進行Western blot實驗,使用泛素一抗檢測泛素化IL-24蛋白;另將細胞裂解液與泛素一抗共孵育,用A/G Plus-Agarose珠子吸附結合有泛素的蛋白質,接著進行Western blot實驗,使用IL-24一抗檢測泛素化IL-24蛋白。
　　 結果:
　　 1.DNA測序結果顯示,成功構建了10個IL-24突變體。
　

4、　 2.質粒分別轉染Hela細胞和HepG2細胞后,Western blot實驗檢測IL-24蛋白表達,相對灰度值分析結果表明IL-24的第五個突變體(第123位賴氨酸密碼子突變?yōu)榫彼崦艽a子)表達的IL-24蛋白量顯著高于pcDNA3.1(+)-IL-24表達的IL-24蛋白,其余各突變體表達的IL-24蛋白量與pcDNA3.1(+)-IL-24比較無統(tǒng)計學意義。
　　 3.質粒分別轉染Hela細胞和HepG2細胞后,免疫沉

5、淀-Western blot實驗檢測泛素化IL-24蛋白,相對灰度值分析結果表明IL-24的第五個突變體表達的泛素化IL-24蛋白量顯著低于pcDNA3.1(+)-IL-24表達的泛素化IL-24蛋白,其余各突變體表達的泛素化IL-24蛋白量與pcDNA3.1(+)-IL-24比較無統(tǒng)計學意義。
　　 結論:
　　 1.成功構建IL-24的10個突變體,DNA測序結果顯示突變成功。
　　 2.IL-24的第123