克羅恩病患者小腸黏膜內(nèi)菌群的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　克羅恩病是一類病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確的慢性、終身性、復(fù)發(fā)性疾病，主要累及胃腸道，和潰瘍性結(jié)腸炎共同隸屬于炎癥性腸病。炎癥性腸病一直是影響北美、歐洲等西方發(fā)達(dá)國家公眾健康的一大困擾，而近年來，隨著經(jīng)濟(jì)和技術(shù)的進(jìn)步，東西方國家之間的聯(lián)系逐漸密切，我們的生活方式及飲食習(xí)慣也逐漸向西方國家靠攏，與此同時(shí)克羅恩病在亞太地區(qū)的發(fā)病率迅速上升，且疾病行為更加復(fù)雜。目前認(rèn)為，遺傳因素、環(huán)境因素與免疫因素均在克羅恩病的發(fā)生、發(fā)

2、展、轉(zhuǎn)歸中起到不可忽視的作用。其中腸道菌群與腸道黏膜之間的相互作用在克羅恩病中的價(jià)值已經(jīng)被越來越多的研究所證實(shí)。然而既往研究中所取得的菌群樣本來源不一，且均集中于糞便、結(jié)腸和回腸末端黏膜，對空腸、回腸等較高位小腸黏膜內(nèi)菌群的研究報(bào)道尚少。本研究通過單氣囊小腸鏡直接獲取小腸黏膜，對其黏膜內(nèi)菌群進(jìn)行測定分析，旨在探討克羅恩病患者小腸病變節(jié)段與正常節(jié)段黏膜內(nèi)菌群的組成差異;克羅恩病患者與非炎癥性腸病患者腸道菌群的組成差異;并探討腸道菌群改變與

3、病情活動度、嚴(yán)重程度的關(guān)系。
　　研究方法：
　　本研究選取2014年10月至2015年10月就診于我院消化內(nèi)科并接受單氣囊小腸鏡檢查的患者，收集其臨床資料，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組為曾經(jīng)確診或本次單氣囊小腸鏡檢查擬診為克羅恩病的患者，對照組為本次SBE檢查腸道未見典型炎癥性腸病樣炎性改變的患者，包括健康對照者。排除以下患者:小腸鏡檢查前1周內(nèi)使用抗生素、益生菌等可能干擾腸道菌群的藥物者;確診為腸結(jié)核、淋巴瘤或白塞氏病等非

4、克羅恩病的患者;無法耐受小腸鏡檢查的患者。在進(jìn)行小腸檢查時(shí)留存小腸黏膜照片，退鏡觀察時(shí)，以小腸鏡活檢鉗取得小腸黏膜樣本，用無菌生理鹽水沖洗至少3遍，置于無菌凍存管中，立即進(jìn)行液氮冷凍，后轉(zhuǎn)移樣本至-80℃冰箱內(nèi)保存。抽提小腸黏膜內(nèi)菌群基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化，后在Illumina MiSeq平臺上進(jìn)行文庫構(gòu)建和基因測序。對腸黏膜菌群測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　研究結(jié)果：
　　本研究共納入患者25例，共收集1

5、52個(gè)黏膜樣本;根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)排除3例患者后，剩余實(shí)驗(yàn)組11例，對照組11例;由于樣本體積受限，最終有8例患者、19個(gè)樣本得以進(jìn)入測序分析階段。其中實(shí)驗(yàn)組共有CD患者5例，分別以A、B、C、D、E編號。其中A、B為初診，C、D、E為復(fù)診;對照組患者共有3例，分別編號為F、G、H。
　　測序結(jié)果表明，在門水平上，所有樣本中含量最多的均為厚壁菌門（Firmicutes），實(shí)驗(yàn)組中厚壁菌門含量比例范圍為56.38％～69.77％，對照組比

6、例范圍為57.75％～0.31％。菌群豐度的差異也主要由此而產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)組樣本中，含量次之的為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門(Actinobacteria);而對照組樣本中，含量排行前四位的與實(shí)驗(yàn)組一致，但擬桿菌門（Bacteroidetes）所占的比例明顯高于變形菌門（Proteobacteria），這與以往研究相符。
　　在屬的水平上，實(shí)驗(yàn)組含量由多到少分別為芽孢桿菌屬

7、（Bacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、嗜堿菌屬(Alkaliphilus)、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、拉烏爾菌屬（Raoultella）、海洋桿菌屬（Oceanobacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）;對照組中含量位于前列的分別為毛螺菌科NK4A136組（Lachnospiraceae_NK4A1

8、36_group）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、擬桿菌目S24-7組（Bacteroidales_S24-7_group_norank）、腸球菌屬（Enterococcus）、毛螺菌科某些未分類菌屬（Lachnospiraceae_unclassified、乳球菌屬（Lactococcus）等。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小腸黏膜中芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）比例明

9、顯升高，而梭菌目（Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）和擬桿菌屬（Bacteroides）減少。之前很多研究中提到的普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）并沒有被檢測到，可能是因?yàn)樾∧c黏膜內(nèi)菌群中該菌群的含量過低所導(dǎo)致的。
　　研究結(jié)論：
　　1.CD患者小腸黏膜內(nèi)菌群豐度與多樣性明顯降低;
　　2.菌群豐度方面，在門水平上，CD患者變形菌門（Prote

10、obacteria）比例增加，擬桿菌門（Bacteroidetes）比例減少。
　　3.菌群多樣性方面，在屬水平上，CD患者黏膜內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)明顯失調(diào)，芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）在CD患者的小腸黏膜內(nèi)菌群中的比例明顯升高，而梭菌目（Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）和擬桿菌屬（Bacteroides）減少。
　　4