雷帕霉素通過mTOR信號通路調(diào)控脊髓神經(jīng)元自噬發(fā)揮對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經(jīng)保護作用.pdf

1、目的：探究雷帕霉素（Rapamycin，Rap）是否通過mTOR信號通路調(diào)控脊髓神經(jīng)元自噬發(fā)揮對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Expermental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠神經(jīng)保護作用。
　　方法：45只雌性的C57BL/6小鼠分成正常對照組、EAE模型組及Rap處理組，每組各15只，再隨機將各組小鼠分為甲、乙、丙三個亞組，每組各5只。EAE模型組和Rap處理組采用MOG35-55加完全

2、弗氏佐劑（complete freund's adjuvant，CFA）誘導(dǎo)C57BL/6小鼠制作EAE模型，正常對照組給予注射等量的生理鹽水和不含MOG35-55的CFA，同時Rap處理組自免疫當日起腹腔注射Rap（1kg/mg），每日注射一次，而正常對照組和EAE模型組自免疫當日起腹腔注射等量的滅菌水，每日注射一次，EAE模型組、Rap處理組小鼠癥狀評分連續(xù)三天沒有加重、四肢出現(xiàn)癱瘓甚至死亡作為EAE發(fā)病的高峰期，將小鼠在發(fā)病高峰期

3、時處死，而正常對照組及其它所有未發(fā)病的小鼠在飼養(yǎng)4周以后直接處死，留取小鼠脊髓組織并單獨分離取出腰膨大段組織備用，甲亞組小鼠取出脊髓組織后包埋固定行脊髓病理切片觀察，乙亞組小鼠制備脊髓單細胞懸液后行免疫熒光雙標染色及活性氧類（reactive oxygen species，ROS）含量測定，丙亞組小鼠提取腰髓總蛋白后行Western blot檢測。具體指標檢測如下：1.記錄各組小鼠病程進展過程中的癥狀表現(xiàn)、潛伏期、進展期及高峰期神經(jīng)功能

4、障礙評分。2.HE染色觀察各組小鼠脊髓組織病理改變。3.尼氏染色鏡下觀察發(fā)病高峰期各組小鼠脊髓組織的神經(jīng)元胞質(zhì)中尼氏小體存活情況并對其尼氏小體進行計數(shù)分析。4.免疫熒光雙標法熒光顯微鏡下觀察各組小鼠脊髓組織中LC3與NeuN的表達及共定位情況。5.Western Blot檢測各組脊髓神經(jīng)元細胞中自噬標記物LC3的表達情況。6.Western Blot檢測各組小鼠脊髓組織mTOR自噬通路中mTOR及其下游P70S6K蛋白水平及其磷酸化水平

5、的表達。7.使用化學(xué)熒光法熒光探針DCFH-DA定量檢測三組小鼠脊髓組織中ROS含量。
　　結(jié)果：
　?、俑鹘M小鼠發(fā)病情況、潛伏期、進展期及神經(jīng)功能障礙評分：正常對照組小鼠均未發(fā)病，EAE模型組、Rap處理組小鼠有不同程度的發(fā)病，發(fā)病率分別為:86.7％、60%（P<0.05）。Rap處理組小鼠與EAE模型組相比較，其發(fā)病潛伏期延長（P<0.01），進展期明顯縮短（P<0.01），高峰期神經(jīng)功能障礙評分降低（P<0.05）。

6、
　　②HE染色觀察脊髓組織病理改變：EAE模型組小鼠發(fā)病高峰期脊髓組織中可見在血管的周邊有以單核細胞為主的致炎性細胞大量浸潤，表現(xiàn)為典型的“袖套”樣分布，同時可見血管周圍白質(zhì)有明顯的脫髓鞘改變，而Rap處理組上述病理改變少見。
　　③各組小鼠尼氏染色后脊髓神經(jīng)元病理改變及尼氏小體計數(shù)分析：尼氏染色后鏡下觀察可見EAE模型組小鼠脊髓神經(jīng)元胞質(zhì)中尼氏小體數(shù)量明顯減少，輪廓模糊，而Rap處理組小鼠脊髓神經(jīng)元中尼氏小體數(shù)量較EAE

7、組明顯增多，各結(jié)構(gòu)界限輪廓清晰，尼氏小體計數(shù)結(jié)果顯示：EAE模型組在發(fā)病高峰期時尼氏小體數(shù)量較正常對照組顯著減少（P<0.05）,而Rap處理組尼氏小體數(shù)量較模型組有所增加，但仍少于正常對照組（P<0.05）。
　　④免疫熒光雙標法觀察脊髓組織中LC3與NeuN的表達及共定位情況：在EAE模型組小鼠脊髓神經(jīng)元中LC3散亂分布無明顯點狀聚集現(xiàn)象，而Rap處理組小鼠較EAE模型組LC3呈明顯的點狀聚集，LC3與NeuN的分布基本一致，

8、即LC3主要積聚于脊髓神經(jīng)元中。
　　⑤各組小鼠脊髓神經(jīng)元細胞中自噬標志物LC3的表達情況：發(fā)病高峰期時，EAE模型組LC3表達顯著降低，LC3-II/LC3-I表達水平較正常對照組也明顯下降（P<0.01），而使用Rap干預(yù)后可見LC3表達有所增加，同時LC3-II/LC3-I水平較EAE組升高（P<0.05）。
　　⑥各組小鼠脊髓組織中mTOR自噬通路蛋白的表達情況:EAE模型組及Rap處理組mTOR蛋白磷酸化水平均高于

9、正常對照組，而Rap處理組mTOR蛋白磷酸化水平低于EAE模型組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），P70S6K蛋白磷酸化水平在各組中的表達情況與mTOR蛋白的表達基本一致。
　?、吒鹘M小鼠脊髓神經(jīng)元中ROS含量測定：三組小鼠脊髓神經(jīng)元中ROS含量變化EAE模型組、Rap處理組ROS含量均高于正常對照組（P<0.05），Rap處理組ROS含量較EAE模型組顯著減少(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?、嘞嚓P(guān)性分析

10、：活性氧ROS水平與發(fā)病潛伏期、Nissl標記的神經(jīng)元數(shù)量呈負相關(guān)，與疾病進展期及神經(jīng)功能障礙評分呈正相關(guān)（P均<0.05）；自噬標志物LC3蛋白水平與發(fā)病高峰期ROS含量、磷酸化mTOR及 P70S6蛋白激酶水平呈負相關(guān)（P均<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.C57BL/6小鼠采用MOG35-55免疫制備EAE模型，EAE小鼠潛伏期縮短，進展期延長及神經(jīng)功能障礙明顯，HE染色可見EAE發(fā)病高峰期小鼠脊髓組織大量炎性細胞浸

11、潤，呈典型“袖套樣”改變，血管周圍白質(zhì)脫髓鞘，上述改變說明造模成功。
　　2.EAE小鼠發(fā)病高峰期時脊髓神經(jīng)元中存在著自噬缺陷，導(dǎo)致 ROS清除障礙而使脊髓神經(jīng)元嚴重損害。
　　3.Rap可以延長EAE小鼠發(fā)病潛伏期、縮短進展期、降低神經(jīng)功能障礙評分，并且增加Nissl標記的脊髓神經(jīng)元數(shù)量，提示Rap干預(yù)后可以對EAE小鼠具有神經(jīng)保護作用。
　　4.Rap對EAE小鼠的神經(jīng)保護作用可能是通過它對mTOR信號通路的抑制而