國內(nèi)5種醫(yī)用益生菌產(chǎn)品的菌種分析.pdf

1、益生菌制劑產(chǎn)品菌種與活菌數(shù)含量是其產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。國外益生菌產(chǎn)品的微生物分析表明，部分產(chǎn)品的微生物種屬和活菌數(shù)含量與產(chǎn)品標簽上標注的種屬和數(shù)量不符。然而，國內(nèi)還沒有這方面的研究報道。本課題對國內(nèi)主要的五種醫(yī)用益生菌制劑產(chǎn)品進行菌種分析?？疾炝宋宸N醫(yī)用益生菌制劑多個批次產(chǎn)品的活菌數(shù)含量，有統(tǒng)計意義的反映產(chǎn)品在有效期內(nèi)的活菌數(shù)含量情況。通過結(jié)合表型特征分析法與16SrDNA序列分析法對從產(chǎn)品中分離的10株菌進行種屬鑒定。同時將PCR-DGG

2、E分析方法應用到鑒定益生菌制劑產(chǎn)品菌株組成，為益生菌制劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供快速、可靠、重復性好的分析方法。 方法與結(jié)果：(1)通過篩選獲得到適合的選擇培養(yǎng)基，并用于5種醫(yī)用益生菌制劑25批產(chǎn)品的活菌計數(shù)，計數(shù)結(jié)果顯示：產(chǎn)品Ⅰ中的三種菌的活菌數(shù)變化范圍分別為105～1010CFU/粒、105～108CFU/粒、106～108CFU/粒，產(chǎn)品Ⅱ的活菌數(shù)變化范圍為108～109CFU/粒，產(chǎn)品Ⅲ的活菌數(shù)變化范圍為108～109CFU/

3、粒，產(chǎn)品Ⅳ中的兩種菌的活菌數(shù)變化范圍分別為107～108CFU/粒和108～1010CFU/粒，產(chǎn)品Ⅴ中的三種菌的活菌數(shù)分別為107CFU/粒、106CFU/粒、106CFU/粒。(2)分離純化10株產(chǎn)品菌株，提取單菌株基因組DNA，PCR擴增16SrRNA基因，純化并測定PCR產(chǎn)物序列，將測得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進行同源性分析，并建立系統(tǒng)進化樹。在GenBank數(shù)據(jù)庫中登陸其10株菌的16SrDNA序列，獲得如下序列號：P

4、FK1(DQ295034)，PFK2(DQ295035)，PFK3(DQ295036)，LZCL(DQ295040)，ZCS1(DQ295037)，MMA1(DQ295041)，MMA2(DQ295038)，JSQ1(DQ295042)，JSQ2(DQ295039)，JSQ3(DQ295043)?；诰?6SrDNA序列的Blast和系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明產(chǎn)品Ⅰ中含有的三種菌分別為長雙歧桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌；產(chǎn)品Ⅱ中含有的菌是動

5、物雙歧桿菌；產(chǎn)品Ⅲ中含有的菌是地衣芽孢桿菌；產(chǎn)品Ⅳ中含有的兩種菌是屎腸球菌和枯草芽孢桿菌；產(chǎn)品Ⅴ中含有的三種菌分別為動物雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌。(3)將分離菌株進行形態(tài)、生理和糖發(fā)酵實驗，結(jié)果表明這些表型鑒定的結(jié)論與16SrRNA基因序列同源性分析結(jié)論一致，分離純化5種產(chǎn)品的10株菌中仍有相同的3株菌與標簽標注的不一致，即其中標簽上分別標注為青春雙歧桿菌和長雙歧桿菌的兩株菌鑒定結(jié)果均為動物雙歧桿菌，標簽上標注為嗜酸乳桿菌的

6、菌株鑒定為植物乳桿菌。(4)提取產(chǎn)品及單菌株基因組DNA，PCR擴增16SrDNAⅤ2～Ⅴ3區(qū)，DGGE電泳PCR產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)品樣的條帶數(shù)分析5種產(chǎn)品的微生物組成，通過參照菌株樣及已鑒定的單菌株樣在變性梯度凝膠上的位置鑒定產(chǎn)品Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ的微生物種屬。結(jié)果顯示5種產(chǎn)品都沒有污染雜菌，產(chǎn)品Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ的菌種鑒定結(jié)果與前面兩種鑒定方法的鑒定結(jié)果一致。 結(jié)論： 1.本課題考查了國內(nèi)的5種益生菌制劑25批產(chǎn)品的活菌數(shù)含量，只一個批次

7、產(chǎn)品的活菌數(shù)低于產(chǎn)品標簽標準，說明我國益生菌產(chǎn)品在貨架期基本能保證其活菌數(shù)含量不低于標簽標注的數(shù)量。 2.通過生理生化特征分析、16SrDNA序列分析和PCR-DGGE分析，對5種產(chǎn)品中分離的10株菌進行了種屬鑒定。其中3種產(chǎn)品中各有1株菌株與標簽標注不符，標簽上分別標注為青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌的兩株菌，其鑒定結(jié)果均為動物雙歧桿菌；標簽上標注為嗜酸乳桿菌的菌株，鑒定為植物乳桿菌。 3.在GenBank上登陸了上述10株