N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V表達(dá)受阻導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室采用GnT-V反義cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞的方法，獲得穩(wěn)定表達(dá)株ASGnT-V7721，并用基因芯片技術(shù)檢測其基因表達(dá)與SMMC7721細(xì)胞的差別，發(fā)現(xiàn)ASGnT-V7721細(xì)胞基因表達(dá)符合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特征。而且，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子GRP78和XBP1及PERK的變化也證明了ASGnT-V7721細(xì)胞存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了進(jìn)一步證明GnT-V表達(dá)受阻特異性地誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，本論文采用RNAi技術(shù)，構(gòu)建GnT-VsiR

2、NA表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞，通過檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞GnT-V的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平驗(yàn)證該GnT-VsiRNA表達(dá)質(zhì)粒對細(xì)胞GnT-V表達(dá)的抑制作用，并且通過HRP標(biāo)記凝集素ConA和DSA對細(xì)胞總蛋白的染色驗(yàn)證GnT-V表達(dá)抑制后其功能的變化。也就是說，GnT-VsiRNA表達(dá)質(zhì)粒不但抑制了GnT-V的表達(dá)，而且阻礙了其功能。然后我們用RT-PCR及Westernblot分別檢測ASGnT-V7721細(xì)胞GRP78和XBP1

3、的mRNA及蛋白表達(dá)的變化，并檢驗(yàn)了細(xì)胞中PERK的磷酸化狀況，發(fā)現(xiàn)GRP78的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量升高；XBP1的mRNA發(fā)生剪接，蛋白分子量從33KD變?yōu)?4KD；PERK蛋白發(fā)生磷酸化。這些變化都符合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特征。因此這部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為“GnT-V表達(dá)受阻誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”提供了有利的佐證。本室以前的研究發(fā)現(xiàn)，ASGnT-V7721細(xì)胞在全反式維甲酸(ATRA)的誘導(dǎo)下凋亡敏感性增強(qiáng)。而劇烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為了