人肝癌細(xì)胞SMMC-7721過表達(dá)N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V對整合蛋白β1的N-糖鏈結(jié)構(gòu)、蛋白穩(wěn)定性及其功能的影響.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)糖蛋白的糖鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中通過糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶加工而形成。其中N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosaminyltransferase，GnT)是一組催化N-糖鏈生成的加工酶類，主要催化N-糖鏈由高甘露糖型經(jīng)雜合型向復(fù)雜型過渡并形成外圍天線結(jié)構(gòu)。根據(jù)加工產(chǎn)物的不同，可將N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶分為六種，分別為GnT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。如果這些糖基轉(zhuǎn)移酶缺失或過表達(dá)，就會造成具有重要功能的糖蛋白糖鏈改變

2、，進(jìn)而影響其功能。 糖蛋白糖鏈最常見的變化是N-糖鏈分子量大小和分支數(shù)變化。N-糖鏈分支數(shù)增加，往往歸因于N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅴ(GnT-Ⅴ)的過表達(dá)。GnT-Ⅴ是分布在高爾基體中的合成糖蛋白N-糖鏈分支結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶，將GlcNAc基團(tuán)轉(zhuǎn)移至N-糖鏈核心α1，6臂的α-甘露糖上，催化形成N-糖鏈的GlcNAcβ1，6分支結(jié)構(gòu)。GnT-Ⅴ加工眾多糖蛋白，其中很多膜蛋白是細(xì)胞表面的粘附分子，GnT-Ⅴ過表達(dá)引起細(xì)胞表面粘附分子糖

3、鏈改變，GlcNAcβ1，6分支增加。已有大量報道由GnT-Ⅴ引起的細(xì)胞表面粘附分子糖鏈G1cNAcβ1，6分支增加與腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移密切相關(guān)。又有研究發(fā)現(xiàn)GnT-Ⅴ有一種與糖基轉(zhuǎn)移酶酶活性無關(guān)的功能，就是可引起腫瘤血管生成，而血管生成是腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程關(guān)鍵的一步。這些研究結(jié)果提示我們：GnT-Ⅴ參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制是多方面的。 我們前期實(shí)驗(yàn)用GnT-Ⅴ轉(zhuǎn)染7721細(xì)胞，觀察到一個值得注意的現(xiàn)象，就是細(xì)胞重要的粘

4、附分子整合蛋白β1的蛋白表達(dá)與Mock(pcDNA3/7721)細(xì)胞相比顯著增高。GnT-Ⅴ是糖鏈加工的酶，關(guān)于影響細(xì)胞表面粘附分子的蛋白含量方面鮮有報道。為了探討腫瘤細(xì)胞中GnT-Ⅴ影響細(xì)胞惡性程度的分子機(jī)制，研究GnT-Ⅴ的糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性與細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)改變的關(guān)系，根據(jù)文獻(xiàn)，我們構(gòu)建GnT-Ⅴ的C末端去除六個氨基酸序列cDNA的重組質(zhì)粒pcDNA3-△cGnT-Ⅴ，△cGnT-Ⅴ含有幾乎完整的蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域而無酶活性，將其轉(zhuǎn)

5、染至7721細(xì)胞；將GnT-Ⅴ全長表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3-wtGnT-Ⅴ)和空載體(pcDNA3)同時分別轉(zhuǎn)入7721細(xì)胞，并對篩得三株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，已確定外源性△cGnT-Ⅴ或GnT-Ⅴ的cDNA在7721細(xì)胞中表達(dá)，三株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞分別用△c-7721(△cGnT-Ⅴ/7721)細(xì)胞，wt-7721(wtGnT-Ⅴ/7721)細(xì)胞，Mock(pcDNA3/7721)細(xì)胞表示。 首先檢測了Mock，wt-7721，△c-772

6、1細(xì)胞中整合蛋白β1亞基的表達(dá)。與Mock細(xì)胞相比，wt-7721細(xì)胞中整合蛋白β1的表達(dá)比Mock細(xì)胞的高2.4倍左右(主要是成熟型β1增加)；△c-7721中整合蛋白β1的表達(dá)比Mock細(xì)胞的明顯降低。然后用實(shí)時熒光定量PCR方法及RT-PCR方法檢測了Mock細(xì)胞，wt-7721細(xì)胞，△c-7721細(xì)胞中整合蛋白β1亞基的mRNA水平，兩種方法結(jié)果均顯示整合蛋白β1亞基的mRNA水平無顯著差別。進(jìn)一步確認(rèn)了GnT-Ⅴ過表達(dá)對整合蛋

7、白β1亞基的調(diào)節(jié)機(jī)制是在轉(zhuǎn)錄后水平。應(yīng)用同位素脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)(Pulse-chase)，分析了整合蛋白β1的穩(wěn)定性。結(jié)果證明，wt-7721細(xì)胞中整合蛋白β1亞基降解變慢，半衰期16小時左右；而△c-7721細(xì)胞中的整合蛋白β1亞基半衰期不到3小時；Mock細(xì)胞中的整合蛋白β1亞基半衰期10小時左右。凝集素IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：wt-7721細(xì)胞中整合蛋白β1的N-糖鏈呈多天線且GlcNAcβ1，6分支增加；△c-7721細(xì)胞中整合蛋白β1的

8、N-糖鏈呈高甘露糖型。wt-7721細(xì)胞中整合蛋白β1的N-糖鏈GlcNAcβ1，6分支增加與其蛋白的穩(wěn)定性增加一致，說明整合蛋白β1的N-糖鏈GlcNAcβ1，6分支可延長其蛋白的半壽期；△c-7721細(xì)胞由于△cGnT-Ⅴ的轉(zhuǎn)入使內(nèi)源性GnT-Ⅴ的酶活性降低，導(dǎo)致整合蛋白β1的N-糖鏈不能進(jìn)一步加工成熟，其攜帶的N-糖鏈停留在高甘露糖型的不成熟狀態(tài)，然后被蛋白酶體降解。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GnT-Ⅴ對整合蛋白β1的上調(diào)是由于N-糖鏈Gl

9、cNAcβ1，6分支加強(qiáng)其蛋白的穩(wěn)定性，與GnT-Ⅴ的催化活性密切相關(guān)?！鱟-7721由于缺少GnT-Ⅴ活性，導(dǎo)致其整合蛋白β1的穩(wěn)定性下降。 為了闡明糖基轉(zhuǎn)移酶的過表達(dá)使細(xì)胞膜上粘附分子蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)類型的改變是否能夠調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，本文進(jìn)一步研究了N-糖鏈分支數(shù)改變的整合蛋白β1對其介導(dǎo)的信號分子表達(dá)及磷酸化水平變化及其對肝癌細(xì)胞侵襲、遷移及抗凋亡能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，wt-7721中GnT-Ⅴ的過