全反式維甲酸誘導N-乙酰氨基葡萄糖基轉移酶V表達受阻的肝癌細胞通過內質網應激途徑發(fā)生調亡的研究.pdf

1、N-乙酰氨基葡萄糖基轉移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)是分布在高爾基體中的一種重要的N-糖鏈加工酶,它以UDP-GlcNAc為供體,催化七糖二天線階段或八糖三天線階段的N-糖鏈形成三天線及四天線N-糖鏈。GnT-V與腫瘤的發(fā)生和轉移相關,其產物GlcNAcβ1,6Manα1,6結構與多種癌細胞的轉移潛力有關。本室研究發(fā)現,GnT-V表達受阻增加了人肝癌SMMC7721細胞對全反式維

2、甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)誘導的凋亡的敏感性,但機制尚不明確。此外,我們還發(fā)現內質網應激發(fā)生于GnT-V表達受阻的SMMC7721細胞。在本論文中,我們進一步探討了ATRA誘導GnT-V表達受阻的SMMC7721細胞發(fā)生凋亡的機制,并將其與內質網應激聯系起來。
　　在前期的研究中我們發(fā)現GnT-V反義cDNA穩(wěn)定轉染的SMMC7721細胞(GnT-V-AS/7721)中存在持續(xù)的慢性的內質網應

3、激。從本論文的第一部結果我們得出結論:ATRA通過加劇GnT-V-AS/7721細胞中的內質網應激誘導細胞凋亡。在80μMATRA處理24小時的GnT-V-AS/7721細胞中,我們發(fā)現內質網應激標志性分子GRP78/Bip(glucose regulated protein 78/immunoglobulin chain binding protein)、CHOP(C/EBP homologus protein)及剪接后XBP1(X

4、box binding protein 1)的表達上調,這些結果都說明ATRA加劇了本來存在于GnT-V-AS/7721細胞中的內質網應激。此外,ATRA處理的GnT-V-AS/7721細胞中還發(fā)現了caspase-12、-9和-3的剪切激活以及凋亡形態(tài)學變化,說明ATRA誘導了細胞凋亡。以上的所有結果表明,ATRA通過加劇GnT-V-AS/7721細胞中的內質網應激誘導細胞凋亡。這為我們提供了一個ATRA誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡的新機制。

5、進一步的研究結果發(fā)現,80μMATRA顯著抑制GnT-V-AS/7721細胞中GnT-V的表達,這可能是ATRA加劇GnT-V-AS/7721細胞中內質網應激的機制之一。
　　在論文的第二部分,我們在80μMATRA處理的GnT-V-AS/7721細胞中檢測到GRP78/Bip、CHOP、剪切后ATF6(activating transcription factor 6)蛋白及XBP1mRNA剪接產物的上調,caspase-3、P

6、ARP[Poly(ADP-ribose)polymerase]也發(fā)生了剪切,這再次證明ATRA加劇了GnT-V-AS/7721細胞中的內質網應激并誘導細胞凋亡的結論。更重要的是,我們發(fā)現ATRA抑制了GnT-V-AS/7721細胞中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代謝酶CBS(cystathionine-β-synthase)和BHMT(betaine-homocysteine methyltransferase)的表達

7、,增加了細胞內Hcy濃度,并降低了細胞內GSH(glutathione)水平。為了觀察ATRA對細胞Hcy代謝的作用,我們用不同濃度的外源性Hcy處理細胞。結果發(fā)現,ATRA處理使GnT-V-AS/7721細胞中的Hcy濃度快速提升到一個很高的水平,這說明ATRA干擾了GnT-V-AS/7721細胞的Hcy代謝,造成了細胞內Hcy堆積,因而增加了GnT-V-AS/7721細胞對外源性Hcy誘導的內質網應激的敏感性。同時,我們也觀察到了G

8、RP78/Bip的顯著上調和XBP1mRNA的完全剪接。進一步的研究發(fā)現,在GnT-V-AS/7721細胞中,ATRA降低細胞內GSH濃度,并阻礙了外源性Hcy誘導的GSH水平的提高。所有的結果表明,ATRA通過抑制Hcy代謝關鍵酶CBS和BHMT的表達提高細胞內Hcy水平、降低細胞內GSH濃度,從而加劇了GnT-V-AS/7721細胞中的內質網應激并誘導細胞凋亡。值得一提的是,來源于正常肝組織的L02細胞對ATRA誘導的凋亡不敏感,A