肝癌細胞中miR-32表達及其對抑癌基因ADAMTS9調控作用.pdf

1、目的：
　　許多微小RNA(microRNAs，miRNAs)在原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)中表達異常，提示miRNAs有可能影響肝癌的發(fā)生及發(fā)展過程，但其作用機制尚不完全清楚。帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解聯蛋白金屬蛋白酶9（a disintegrin and metallo-proteinase with thrombospondin motifs-9， ADAMTS9)是新近發(fā)現的腫瘤抑制因子，它在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程起

2、重要作用。本實驗主要通過實時熒光定量PCR(quantitative Real-time fluorescent quantitative PCR, qRT-PCR)的方法研究人肝癌細胞株SMMC-7721、Huh7、HepG2中miR-32的表達豐度，并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)探討miR-32是否對ADAMTS9具有調控作用，從而評價miR-32與ADAMTS9在肝癌細胞中的作用，這將為進一步研究肝癌的發(fā)病機制拓展新的思路，并在肝癌

3、的早期診治及生物治療中擁有廣泛的應用前景。
　　材料和方法:
　　1、材料及試劑
　　人肝癌細胞株SMMC-7721購自中國科學技術研究院上海細胞庫，人肝癌細胞株Huh7、人肝癌細胞株HepG2及人腎上皮細胞293T細胞株來自河北醫(yī)科大學實驗室；miR-32過表達質粒和雙熒光素酶報告基因3’UTR質粒由上海吉凱基因化學技術有限公司構建合成； miR-32-5p inhibitor/NC由廣州銳博生物有限公司合成。

4、>　　所用主要試劑有：DMEM高糖（Hyclone），RPMI1640（Gibco）；標準胎牛血清（四季青）；胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）（Solarbio）；青鏈霉素混合液（100x）（雙抗 Solarbio）；lipofectamine2000（invitrogen）；總RNA提取試劑（上海捷瑞公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒（Promega）；逆轉錄引物、實時熒光定量PCR引物（In

5、vitrogen公司）。
　　2、細胞培養(yǎng)
　　人肝癌細胞株 SMMC-7721、人肝癌細胞株 Huh7、人肝癌細胞株HepG2及人腎上皮細胞293T細胞株分別以含10％胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),每2-3天使用0.25%胰蛋白酶進行消化、傳代,取對數期細胞用于后續(xù)實驗。
　　3、總RNA提取
　　將細胞用PBS漂洗2次后加入4℃預冷的

6、Trizol lml，冰上放置5min，加入氯仿200ul，劇烈晃動EP管約15s，冰上放置10min后4℃，8800rpm離心15min，將上清液轉移到新的1.5ml RNase-free EP管中，加入0.5ml異丙醇，-20℃放置10min后4℃，8800rpm離心15min，用75％乙醇漂洗一次，再次離心后將乙醇晾干，用20ul滅菌DEPC水溶解沉淀的RNA過夜。用紫外分光光度計讀取OD260/OD280，-80℃保存?zhèn)溆谩?b

7、r>　　4、qRT-PCR檢測
　?。?）RNA逆轉錄反應：檢測 miR-32的表達時，向總 RNA中加入miR-32特異性莖環(huán)引物:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACT GCAACTT-3’；檢測ADAMTS9 mRNA表達時，加入逆轉錄試劑盒中的隨機引物。按照逆轉錄試劑盒逆轉錄得到 cDNA，設置反應條件為25℃5min，42℃60min，70℃15min，4℃+∞。

8、(2)qRT-PCR：按照 qRT-PCR試劑盒配制20uL反應體系， miR-32上游引物為：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；下游引物為：5’-GCCGCTATTGCA CATTACTAAGTT-3’， ADAMT9上游引物為：5’-CATAATGAACAGGATGGGCCT-3’；下游引物為5’-TTGACCACATCCAGGGGTTG-3’，SYBR Green qRT-PCR擴增反應參數設置:95℃10min

9、，95℃15S，55℃（ADAMTS9 mRNA為57℃）30S，72℃30S，40個循環(huán),每個樣品設置3個平行管,每次實驗重復3次;(3)數據分析相對表達水平用2-??Ct方法計算，miR-32的表達選用U6基因為內參，ADAMTS9 mRNA的表達選用β-actin基因為內參。
　　5、細胞轉染
　　miR-32過表達質粒組及 miR-32-5p inhibitor組瞬時轉染人肝癌細胞株SMMC-7721。取處于對數生長

10、期的細胞按1×106個/孔接種于6孔板,隨后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至細胞密度達70%后，采用脂質體法瞬時轉染肝癌細胞株SMMC-7721，miR-32過表達質粒組按質粒(ug):脂質體(ul)=1∶2的比例轉染；miR-32-5p inhibitor組使miR-32-5p inhibitor終濃度為150nm進行轉染,轉染后將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換為含血清培養(yǎng)基,24h后收集細胞，提取RNA。
　　

11、6、雙熒光素酶報告基因檢測
　　取處于對數生長期的人腎上皮細胞293T細胞接種于24孔板,置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時，細胞密度達70%,將細胞分為6組:共轉染 PmiR-ADAMTS9-NC和 mir-NC組、共轉染PmiR-ADAMTS9-NC和 miR-32組、共轉染 PmiR-ADAMTS9-WT和mir-NC組、共轉染 PmiR-ADAMTS9-WT和 miR-32組、共轉染PmiR-ADAMTS9-

12、Mut和miR-32-NC組、共轉染PmiR-ADAMTS9-Mut和miR-32組，轉染方法同前。轉染24 h后吸盡細胞培養(yǎng)液，使用1xPBS清洗細胞2遍，每孔加入100uL稀釋好的1xPLB，搖床常溫條件下進行裂解。將白色不透光的96孔酶標板置于多功能酶標儀內，每孔加入之前的細胞裂解液20uL，做3個平行孔，實驗重復3次，每孔分別加入100uL預先混好的螢火蟲熒光素酶檢測緩沖液，測定 Firefly luciferase，檢測完成后

13、加入100uL海腎熒光素酶檢測工作液，測定 Renilla luciferase，用Firefly luciferase除以Renilla luciferase，所得值作為相對熒光素酶活性。
　　7、統(tǒng)計學處理實驗數據以mean±SD表示，實時熒光定量PCR采用單因素方差分析，雙熒光素酶報告基因檢測采用t檢驗比較組間差異，實驗所得數據資料采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件分析, P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:

14、r>　　1、SMMC-7721, Huh7, HepG人肝癌細胞株中miR-32的表達
　　使用紫外分光光度計檢測所提取的RNA濃度及純度，發(fā)現3株肝癌細胞總RNA的A260nm／A280nm比值在1．8～2．0之間,說明總RNA純度較高，未見明顯降解。
　　qRT-PCR的熔解曲線顯示，miR-32及U6基因分別在80℃與82℃溶解曲線呈單峰,說明引物特異性良好, qRT-PCR結果可信。從擴增曲線中可以看出，擴增曲線均為

15、S型曲線，各個樣本的模板質量良好，可得到較合適有效的擴增。分析結果顯示:3株肝癌細胞(SMMC-7721，HepG2，Huh7)中miR-32的表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05），我們選用SMMC-7721進一步研究。
　　2、人肝癌細胞株SMMC-7721轉染后miR-32及ADAMTS9 mRNA表達情況
　　使用紫外分光光度計檢測所提取的RNA/質粒濃度及純度，溶解曲線及擴增曲線分析方法同2.1。
　　SMMC-7

16、721轉染后各組間相比較， miR-32表達豐度分析結果顯示:miR-32質粒轉染組中miR-32表達上調（P<0.05），轉染miR-32-NC質粒組則無明顯差異(P>0.05)；miR-32-5p inhibitor轉染組中miR-32表達下調（P<0.05），轉染miR-32-5p-NC質粒組則無明顯差異(P>0.05)。
　　SMMC-7721轉染后各組間相比較，ADAMTS9 mRNA表達情況分析結果顯示:轉染miR-3

17、2質粒組與轉染miR-32-NC質粒組ADAMTS9 mRNA相比較表達下調（P<0.05），與空白組相比則無明顯變化(P>0.05)；轉染miR-32-5p inhibitor組與轉染miR-32-5p inhibitor NC組ADAMTS9 mRNA相比較表達上調（P<0.05），與空白組相比較表達上調（P<0.05）。
　　3、雙熒光素酶報告基因檢測結果
　　293T細胞轉染24h后檢測熒光素酶活性并將其標準化，結果

18、顯示：在轉染PmiR-ADAMTS9-wt組中，轉染miR-32同miR-32-NC相比熒光素酶活性降低（ P<0.05）；當同時轉染miR-32時， PmiR-ADAMTS9-wt組與PmiR-ADAMTS9-mut組相比熒光素酶活性也同樣出現了降低（P<0.05），結合以上結果說明miR-32可與ADAMTS9 mRNA3'-UTR結合，抑制熒光素酶活性，當未結合時，熒光素酶活性回復升高。
　　結論：
　　miR-32通