肝癌患者血漿ADAMTS9和RNF180基因DNA甲基化檢測(cè)及意義.pdf

1、目的:ADAMTS9及RNF180是新發(fā)現(xiàn)的兩種抑癌基因，其中ADAMTS9主要通過抑制血管形成來抑制腫瘤的生長(zhǎng)，RNF180通過調(diào)節(jié)靶蛋白底物的泛素化而在細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育過程中發(fā)揮作用。既往人們已在其他腫瘤組織中檢測(cè)到這兩個(gè)基因的異常甲基化，之前我們也已在肝癌組織中研究了這兩個(gè)基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在肝癌組織中的甲基化率明顯高于肝硬化及正常組織，表明這兩個(gè)基因的甲基化狀態(tài)可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，并且這兩個(gè)基因的甲基化狀態(tài)對(duì)肝

2、癌患者的病情評(píng)估及預(yù)后判斷也具有一定的價(jià)值。但基于組織標(biāo)本的研究創(chuàng)傷性較大且獲取困難，不適宜用于腫瘤的篩查及早期檢測(cè)，相較而言血漿及血清標(biāo)本則比較容易獲得，且創(chuàng)傷性小。既往已有研究證明腫瘤組織與配對(duì)血漿或血清樣本中DNA甲基化的改變具有一致性，表明血漿中DNA甲基化狀態(tài)有望成為一種新的腫瘤標(biāo)記物。因此，本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反立(methylation specific PCR，MSP)的檢測(cè)方法，對(duì)肝癌、肝硬化及健康人的血漿標(biāo)

3、本DNA進(jìn)行抑癌基因ADAMTS9，RNF180啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化檢測(cè)，研究其對(duì)肝癌的診斷價(jià)值，并分析其與臨床資料及生存期預(yù)后的關(guān)系，篩選出對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展、臨床診斷及預(yù)后判斷具有重要價(jià)值的新的血清學(xué)標(biāo)志物。
　　方法:
　　1研究對(duì)象:2009年4月至2011年9月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科住院的肝癌患者90例，肝硬化患者65例及健康人80例。90例肝癌患者血漿標(biāo)本收集前均未做任何治療，包括手術(shù)、化療及介入治療。90例

4、肝癌患者中男性72例，女性18例，年齡為33～77歲，平均年齡為(56.41±10.76)歲，65例肝硬化患者中，男性患者45例，女性患者20例，年齡在23～78歲，平均年齡為(58.82±9.85)歲。依據(jù)巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona clinic liver cancer，BCLC)分期對(duì)90例肝癌患者進(jìn)行臨床分期，其中A期、B期、C期、D期的例數(shù)分別為27例、16例、33例和14例。收集所有患者病史、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等臨床資

5、料，通過電話聯(lián)系的方式對(duì)肝癌患者進(jìn)行隨訪，并計(jì)算其生存時(shí)間。
　　2抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化檢測(cè)方法:
　　將經(jīng)EDTA抗凝的全血(約2ml)經(jīng)2500rpm離心2分鐘后取上清液得到血漿標(biāo)本，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取血漿DNA，用BisulFlash DNA Modification Kit甲基化試劑盒進(jìn)行血漿DNA甲基化修飾及純化，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，采用甲基化特異性PCR

6、的方法檢測(cè)血漿中ADAMTS9及RNF180基因DNA甲基化狀態(tài)。PCR擴(kuò)增引物的序列分別是:ADAMTS9基因甲基化的引物序列為:上游引物5'-ttgttcgttcgttgggtattatgcg-3'，下游引物5'ccaacttttaactttaaaaatcgct-3'，非甲基化的引物序列為:上游引物5'-tgtttgtttgttgggtattatgtgg-3'，下游引物5'-ccaactttaactttaaaaatcact-3'RN

7、F180基因甲基化的引物序列為:上游引物5'gacgtggggcgagtaggtcgtt-3'，下游引物5'-ccgaccgaaaccaaatccctccgaa-3'，非甲基化的引物序列為:上游引物:5'-gatgtggggtgagtagggttgtt-3'，下游引物5'ccaaccaaaaccaaatccctccaaa-3'。對(duì)抑癌基因ADAMTS9、RNF180進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行甲基化結(jié)果分析判定。

8、
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1肝癌、肝硬化及健康人血漿中ADAMTS9、RNF180基因甲基化狀態(tài)及比較
　　ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率在肝癌和肝硬化血漿中分別為15.56％(14/90)和3.08％(2/65)，健康人血漿中未發(fā)現(xiàn)甲基化0％(0/80)，三組的甲基化陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=18.1

9、24，P=0.000＜0.05)。對(duì)肝癌組及肝硬化組血漿DNA甲基化進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.349，P=0.012＜0.05)。健康人組與肝癌組血漿DNA甲基化進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=13.561，P=0.000＜0.05)。健康人組與肝硬化組血漿DNA甲基化進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.199＞0.05)。
　　RNF180基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率在肝癌和肝硬化血漿中分別為6.67％(6/90)和4

10、.62％(3/65)，健康人血漿中未發(fā)現(xiàn)甲基化0％(0/80)，三組的甲基化陽性率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.261，P=0.072＞0.05)。對(duì)肝癌組及肝硬化組血漿DNA甲基化進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.036，P=0.849＞0.05)。健康人組分別與肝癌組及肝硬化組血漿DNA甲基化進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.053，P=0.175)。
　　2肝癌血漿中ADAMTS9，RNF180基因甲基化狀態(tài)與臨床資

11、料的比較
　　90例肝癌患者血漿中ADAMTS9，RNF180基因甲基化狀態(tài)與患者的年齡、性別、Child-pugh分級(jí)、AFP值大小、腫瘤個(gè)數(shù)、HBsAg是否陽性、BCLC分期及是否伴有肝硬化、有無門靜脈瘤栓、是否伴有轉(zhuǎn)移均無關(guān)，各組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　以AFP≥400ug/L為陽性標(biāo)準(zhǔn)，AFP＜400ug/L認(rèn)為AFP檢測(cè)陰性。90例肝癌患者中AFP檢測(cè)陽性的例數(shù)為39例，占43.33％，在剩余的

12、51例AFP陰性病例中9例發(fā)生了ADAMTS9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，占17.65％，4例發(fā)生了RNF180基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，占7.84％。聯(lián)合檢測(cè)血漿ADAMTS9和RNF180基因甲基化陽性率為18.89％(17/90)，兩種基因甲基化狀態(tài)檢測(cè)聯(lián)合AFP檢測(cè)的肝癌檢出率為55.56％(50/90)。
　　3血漿ADAMTS9，RNF180基因甲基化檢測(cè)對(duì)肝癌的診斷價(jià)值
　　在肝癌、肝硬化及健康人三組共235例血漿標(biāo)本中，

13、ADAMTS9基因甲基化對(duì)肝癌檢測(cè)的靈敏度為15.6％，特異度為98.6％; RNF180基因甲基化對(duì)肝癌檢測(cè)的靈敏度為6.7％，特異度為97.9％;聯(lián)合ADAMTS9及RNF180基因甲基化檢測(cè)對(duì)肝癌檢測(cè)的靈敏度為18.9％，特異度為96.6％。
　　4肝癌血漿ADAMTS9，RNF180基因甲基化狀態(tài)與生存期預(yù)后的關(guān)系及肝癌預(yù)后因素分析
　　ADAMTS9基因甲基化陽性患者的平均生存時(shí)間為(23.714±6.576)個(gè)月

14、;ADAMTS9基因甲基化陰性患者的平均生存時(shí)間為(16.054±2.028)個(gè)月。兩組生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.321＞0.05)。
　　RNF180基因甲基化陽性患者的平均生存時(shí)間為(23.000±10.518)個(gè)月;RNF180基因甲基化陰性患者的平均生存時(shí)間為(16.715±2.006)個(gè)月。兩組生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.653＞0.05)。
　　對(duì)肝癌患者的年齡、性別、Child-pugh分

15、級(jí)、AFP值、腫瘤數(shù)目、HBsAg是否陽性、有無門靜脈瘤栓、肝癌BCLC分期共8個(gè)因素進(jìn)行Log-Rank單因素分析，發(fā)現(xiàn)門靜脈瘤栓的有無及child-pugh分級(jí)對(duì)肝癌患者的生存率有影響，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P=0.020，P=0.040)。
　　進(jìn)一步COX多因素分析結(jié)果提示，Child-pugh分級(jí)及門靜脈瘤栓有無為肝癌生存期預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因子(P=0.024＜0.05，P=0.006＜0.05)，其他9項(xiàng)因素均不能作為

16、肝癌生存期預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因子。
　　結(jié)論:
　　1肝癌患者血漿中ADAMTS9基因甲基化陽性率顯著高于肝硬化組和健康對(duì)照組，提示ADAMTS9基因甲基化在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起一定作用。
　　2檢測(cè)血漿中ADAMTS9及RNF180基因的甲基化狀態(tài)對(duì)于肝癌診斷的特異度高，但敏感性低，二者甲基化檢測(cè)聯(lián)合AFP檢測(cè)對(duì)于肝癌診斷的敏感性提高仍不明顯，表明該檢測(cè)指標(biāo)不適宜作為肝癌診斷的標(biāo)志物，也不適宜用于高危人群的篩查。