ADAMTS9基因?qū)Χ喟l(fā)性骨髓瘤作用及機制研究.pdf

1、目的:多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是漿細胞惡性增殖性疾病，在血液腫瘤疾病中發(fā)病率較高。目前MM的發(fā)病機制仍不清楚，臨床治療十分困難。眾多研究表明表觀遺傳學的調(diào)節(jié)失衡與MM的發(fā)生具有密切關系。ADAMTS9(a disintegrin-like andmetallopeptidase with thrombospondin type1 motif,9)為ADAMTS家族成員之一，有研究證實ADAMTS9參與了腫瘤

2、的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在觀察MM中ADAMTS9基因表達及其啟動子甲基化狀態(tài)，以及ADAMTS9對MM生物學行為的影響，探討該基因在MM發(fā)病機制中的作用。
　　方法:
　　1.應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)觀察MM細胞系RPMI-8226、KM3，MM患者及正常人骨髓樣本ADAMTS9 mRNA的表達。
　　2.運用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)研究RPMI-8

3、226、KM3及MM患者骨髓樣本中ADAMTS9基因啟動子甲基化狀況，正常人骨髓樣本為對照。并分析MM患者臨床資料與 ADAMTS9啟動子甲基化有無相關性。
　　3.體外培養(yǎng)KM3細胞，用去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，Aza)聯(lián)合組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古菌素A(trichostatinA，TSA)處理，采用RT-PCR及MSP分別檢測KM3細胞在藥物干預前后ADAMTS9 m

4、RNA表達及甲基化狀態(tài)有無變化。
　　4.構(gòu)建ADAMTS9表達載體pCEP4-ADAMTS9及空載體pCEP4，轉(zhuǎn)染KM3細胞，以最小致死濃度G418篩選單克隆表達ADAMTS9的細胞，RT-PCR觀察驗證轉(zhuǎn)染效果。
　　5.通過細胞克隆形成實驗，Cell Counting Kit-8(CCK-8)實驗及流式細胞分析觀察KM3細胞在轉(zhuǎn)染ADAMTS9前后生物學行為的變化。
　　結(jié)果:
　　1.ADAMTS9在R

5、PMI-8226表達，而在KM3細胞表達缺失;MM患者和正常人骨髓樣本中ADAMTS9表達率分別為0％(0/15)、100％(15/15)。
　　2.RPMI-8226細胞ADAMTS9啟動子未見甲基化，KM3細胞該基因啟動子則高度甲基化。MM患者和正常人骨髓樣本中ADAMTS9基因啟動子甲基化率分別為66％(37/56)、0％(0/15)。
　　3.ADAMTS9啟動子甲基化與MM患者的年齡、性別、類型等臨床特征均未見顯著

6、相關性(P＞0.05)。
　　4.MM細胞經(jīng)去甲基化藥物處理后，ADAMTS9恢復表達，其甲基化特異性條帶減弱;而RPMI-8226細胞該基因表達在藥物處理前后無明顯變化。
　　5.ADAMTS9質(zhì)粒可成功轉(zhuǎn)染KM3細胞。ADAMTS9表達陽性的KM3細胞克隆形成減少，細胞阻滯于S期，細胞增殖受抑(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.ADAMTS9基因在KM3細胞和MM患者骨髓樣本中表達缺失，RPMI-8226